人胰岛素A_B链基因表达载体的构建与大豆遗传转化

制备根癌农杆菌 EHA105电激感受态细胞 , 挑取以 上测序正确的重组质粒 DNA 转化 EHA105电激感 受态细胞 (电激参数为 :场强 11 kV /cm , 电容为 25 μF )。在转化的抗性平板上随机挑取 12个抗性菌 落 , 提取质粒 DNA, 以上面合成的引物序列为引物 , 按如下反应参数 “ 94 ℃变性 30 s, 52 ℃复性 25 s, 72 ℃延伸 30 s, 共进行 35个循 环 ;最 后 72 ℃延伸 5 m in”进行 PCR检测 。 1. 2. 3 大豆的转化 1. 2. 3. 1 培养基 (以 1 /2M S为基本培养基 , 单位为 1 m g /L) 种子萌发培养基 :0. 8%琼脂 ;预培养基 、 共培养基 :1 /2M S +6 - BA 1 +IBA 0. 05;筛选培养 基 :1 /2M S +6 - BA 1 +IBA 0. 05 +ce.f 500 +Km 100;芽诱导培养基 :1 /2M S +6 - BA 1 +IBA 0. 05 + ce.f 300 +Km 50;芽 伸 长 培养 基 :1 /2M S +6 - BA 0. 25 +IBA 0. 5 +ce.f 300 +Km 50 +GA3 1;生根培养 基 :1 /2M S +NAA 0. 5 +ce.f 100 +Km 50。以上各种 培养基中 , 除生根培养基的蔗糖浓度为 2%和种子萌 发培养基不加蔗糖外 , 其余所有培养基的蔗糖浓度均 为 3%;所有培养基的琼脂浓度均为 0. 8%;pH 值除 共培养基的为 5. 6以外 , 其余的均为 5. 8。 1. 2. 3. 2 大豆种子的处理和外植体的制备 取成 熟吉 30大豆种子按如下方法灭菌 :在 70%酒精中 浸泡 30 s, 迅速 取出 置 于 0. 1% H gC l2 中浸 泡 10 m in, 然后用无菌水洗涤 4次 , 再用无菌水浸泡 3 h。 取出种子接种于种子萌发培养基上 , 置于暗培养箱 中 (22 ±2) ℃暗培养 48 h, 然后再置于人工气候室 中于 (24 ±2) ℃、14 h /d的光照条件下培养 6 ～ 8 d。 取以上培养 7 ～ 10 d苗龄的大豆无菌苗 , 去掉顶芽 , 切取 0. 5 cm 左右的子叶节 , 沿胚轴纵向剖成两半 , 即得到两个子叶节外植体 。 1. 2. 3. 3 根癌农杆菌 EHA105(含 pB I121 - IN 质 粒 )工程菌液的制备 液体培养 EHA105(含 pBI121 - IN 质粒 )至对数期 (OD600 nm =0. 5), 然后转移至 100 m l离心管中 4 ℃、1 800 g 离心 10 m in, 尽可能 去尽上清 。用含 1 m g /L 6 - BA 和 0. 05 m g /L IBA 的 1 /2MS液 体培养 基重悬 浮以上 所得菌 体 , 并使 OD600 nm值达 0. 5, 在使用前 4 ～ 6 h 加入终浓 度为 100 μm o l /L的 AS, 然后用 1 m o l /L NaOH 调 pH 值 至 5. 4, 此即为农杆菌工程菌液 。 1. 2. 3. 4 预培养 、共培养和筛选培养 将按以上外 植体制备方法制备的外植体近轴面朝上接种于预培
各种限制性内切酶均购自 T akara公司 , T4 DNA 连接酶购自 N ew Eng land B io labs公司 , DNA M arke r、Taq DNA 聚合酶等购自上海 Sangon生物工程有 限公司 , 胶回收试剂盒为 Sangon生物工程有限公司 “UN IQ - 10柱式胶回收试剂盒 ”, 测序由大连 T akara公司完成 , 文中提到的其他试剂均为国产分析纯 或化学纯产品 。
提供了全部实验条件 。
酵母 [ 5, 6] 中成功且高效地表达出具生物活性的重组 人胰岛素 , 使重组人胰岛素的构象更接近于人胰岛 素的天然构象 。
大肠杆菌和酵母都是很好的重组人胰岛素表达 系统 , 但是应用大肠杆菌和酵母生产的重组人胰岛 素 , 大都需要经过体外加工 , 程序复杂 , 成本较高 , 而 且生产的重组人胰岛素的活性也都不及天然人胰岛 素 。 本研究采用大豆偏爱密码子化学合成人胰岛素 A、B 链基因 , 通过根 癌农杆菌 介导法转 化大 豆植 株 , 以期为重组人 胰岛素的生产 提供一条简便 、高 效 、廉价的生产途经 , 并对医用蛋白大豆表达系统的 建立和完善进行有益的探索 。
人胰岛素是由人胰腺 β 细胞生成和分泌的一 种蛋白质激素 。 成熟人胰岛素由 A、B 两条多肽链 组成 , A 链含有 21个氨基酸残基 , B链含有 30个氨 基酸残基 , 并含有两个链间二硫键 (A 7 - B7, A 20 B19)和一个链内二硫键 (A6 - A11)。 在体内人胰 岛素随血液运送到靶标组织 , 通过与专一性膜受体 结合而行使调节糖代谢 、脂肪代谢和蛋白质代谢的 功能 , 是迄今为止糖尿病控制最有效的药物 。
20世纪 80年代以前 , 临床用胰岛素一直由猪 、 牛等动物胰腺中提取而获得 。 但这些产品纯度低 , 加之与人胰岛素相比在结构上存在差异 , 故有免疫 原性 , 注射后易引发胰岛素过敏 、注射部位肌肉萎缩 和胰岛素抗性等副作用 。 为了克服动物胰岛素的以 上缺陷 , 20世纪 70年代以后相继出现了全合成和 半合成人胰岛素产品 。但由于它们都是采用蛋白质 的化学合成方法 , 收率低 、成本高 , 无法广泛用于临 床用药 。直到 20世纪 70年代末 80年代初 , 人们在 人胰岛素生 产研究 上才取 得重大 突破 。 1977 年 , U llrich等 [ 1] 首先报 道了在微生物中合成了重组鼠 胰岛素 。 1981年 , F rank 等[ 2] 首先报道了在大肠杆 菌中成功地表达了重组人胰岛素 , 这也是第一个基 因工程药物 。 20世纪 80年代和 90年代 , 人们又建 立起人胰岛素酿酒酵母 (S. cerevisiae)和毕赤酵母 (P. pastoris)表达系统 , 分别在酿酒酵母 [ 3, 4] 和毕赤
DO I 牶牨牥牣牨牭牳牳牴牤j牣issn牣牨牥牥牪牠牨牫牥牪牣牪牥牥牭牣牥牪牣牥牥牴 江苏农业科学 2005年第 2期
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人胰岛素 A、B链基因表达载体的构建与大豆遗传转化
龚 剑 1 , 刘春林2 , 郭 纯 3
(1. 湖州师范学院生命科学院 , 浙江湖州 313000;2. 湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室 , 湖南长沙 410128; 3. 湖南中医学院药学院 , 湖南长沙 410007)
收稿日期 :2004 - 11 - 26 作者简介 :龚 剑 (1977— ), 男 , 广西桂林人 , 硕士 , 主要从事分 子生
物学研究 。 Tel:(0572)2320593;E -m ai l:gongjian@ hu tc. z .j cn。 致谢 :感谢湖南农业大学作物基因工程湖南 省重点实 验室为本 课题
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1. 2 实验方法 1. 2. 1 人胰岛素 A、B 链基因的合成 在 G enebank 上随机抽取大豆内源蛋白的 cDNA 序列 , 利用密码 子分析软件分析各氨基酸的各同义 密码子使用情
况 , 得出大豆偏爱密码子 使用情况表 。再根据 G enebank上人胰岛素 A、B 链氨 基酸序列 (登陆号 为 AY138590), 设计人胰岛素 A、B 链基因 DNA 序 列 。 A、B 链 之 间 用 B amH I位 点 连 接 , 并 在 B 链 DNA 序列前加上起始密码子 ATG 和 SnabI、XbaI酶 切位点 , 在 A 链后面加上终止密码子 TGA 和 Sm aI、 A vrII酶切位点 。最后送上海 Sangon生物工程有限 公司进行全基因合成 , 由上海 Sangon生物工程有限 公司提供含目的基因的重组质粒 pUC18 - IN 和含 此质粒的大肠杆菌 DH 5α菌株 。 1. 2. 2 人胰岛素 A、B 链基因植物表达载体 pB I121 - IN 的构建 1. 2. 2. 1 pUC18 - IN 和 pB I121质粒 DNA 的提取 和纯化 方法参照分子克隆[ 7] 。 1. 2. 2. 2 质粒 DNA 的酶切 、DNA 大小片段的回收 和连接 用 Sm aI和 XbaI完全双酶切 pUC 18 - IN和 pB I121质粒 DNA, 用胶回收试剂盒回收酶切得到的 目的基因 IN 片段和 pB I121质粒 DNA 大片段 , 用 T4 DNA 连接酶连接 IN 片段和 pBI121质粒 DNA 大片 段 , 连接产 物电激转 化大肠杆 菌 DH 5α(电激参数 为 :场强 12. 5 kV /cm, 电容为 25 μF)。质粒 DNA的 酶切和连接按限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶的厂 家说明书进行 , IN 片段和 pB I121 质粒 DNA 大片段 的回收按胶回收试剂盒的说明书进行 , DH 5α电激 感受态细胞的制备和电激转化按分子克隆 [ 7] 进行 。 1. 2. 2. 3 重组载体的鉴定 在得到的 Km 抗性平 板上随机挑取 22个抗性菌落 , 按分子克隆[ 7] 的碱裂 解小量法分别提取质粒 DNA, 依据合成的目的基因 两端 DNA 序列和引物设计原则设计引物如下 :
P1:5′-G TTTG TGAACCAA CA CCTT - 3′ P2:5′-GGG TCAG TTGCAG TAGTTC - 3′ 以提取的质粒 DNA 为模板 , 按如下 反应参数 “ 94 ℃变性 30 s, 52 ℃复性 25 s;72 ℃延伸 30 s, 共 进行 35个循环 ;最后 72 ℃延伸 5 m in”进行 PCR筛 选 。筛选得到的阳性质粒 DNA, 进行 Sm aI和 XbaI 双酶切检测 。并随机挑取两个双酶切呈阳性的质粒 DNA 送大连 T akara公司进行测序 。 1. 2. 2. 4 重组载体转化 EHA105 受体细胞 按分 子克隆 [ 7] 中大肠杆菌电激感受态细 胞的制备方法
1 材料与方法
1. 1 材料 大肠杆菌 DH 5α、根癌农杆 菌 EHA105和 质粒
pB I121 均 由 湖 南 农 业 大 学 作 物 基 因 工 程 湖 南 省 重 点实验室提供 ;常规大豆品种吉 30由吉林省农业科 学 院 生 物 技术 重 点 开 放 实 验 室 袁 鹰 老 师 惠 赠 ; pUC18 - IN (合成的人胰岛素 A、B 链基因与 pUC18 质粒 DNA 的重组质粒 )由上海 Sangon生物工程有 限公司合成 ;引物 由北京 奥科 生物 技术 有限公 司 合成 。
摘要 :使用大豆偏爱密码 子 , 人工合成人胰岛素 A、B 链基因 IN。 将合 成的人胰岛 素 A、B 链基因 IN 与 携带 有 CaM V 35S 启动子的质粒 pBI121重组 , 构建成 IN 植物表 达载体 pBI121 - IN 。 再以大 豆品种 吉 30 子叶节 为外 植体 , 以根癌农杆菌 EHA 105介导进行遗传转化 , 在筛选培养基上直接 诱导分化 , 获得了 Km 大豆抗性苗 。 关键词 :人胰岛素 ;基因表达 ;大 豆 ;遗传转化 ;载体 中图分类号 :S565.103. 53 文献标识码 :A 文章编号 :1002 - 1302(2005)02 - 0027 - 04
养基上 , 在 (24 ±2) ℃、14 h /d的光照条件下预培养
龚 剑等 :人胰岛素 A、B链基因表达载体的构建与大豆 遗传转化
— Hale Waihona Puke Baidu9 —
48 h。 再 将 外 植 体 在 根 癌 农 杆 菌 EHA105 (含 pB I121 - IN 质粒 )工程菌液中浸染 15 m in, 取出外 植体置于无菌滤纸上吸干多余菌液 。 然后 , 近轴面 朝下接种于共培养基上 , 于暗培养箱中 (24 ±2) ℃ 暗培养 48 h。 再近轴面朝上转 接种至筛选培养基 上 , 置于人工气候室中于 (24 ±2) ℃、14 h /d的光照 条件下进行筛选培养 。 在筛选培养阶段 , 每 7 d转 接 1次 。 1. 2. 3. 5 芽诱导 、芽伸长及生根培养 将以上经筛 选培养得到的抗性外植体转接至芽诱导培养基上诱