应用RT-PCR技术检测AFP

应用
1、分析基因的转录产物
2、获取目的基因
3、合成cDNA探针 4、构建RNA高效转录系统
试剂准备 1．RNA提取试剂 2．第一链CDNA合成试剂盒
3．DNTPMIX：含DATP、DCTP、DGTP、 DTTP各2MM 4．TAQ DNA聚合酶
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1. 总RNA的提取 2. CDNA第一链的合成：
（1）在0.5ML微量离心管中，加入总RNA 1-5ΜG，补充适量的DEPC H2O使总体积达11ΜL。在管中加10ΜM OLIGO（DT）12-18 1ΜL，轻 轻混匀、离心。 （2）70℃加热10MIN，立即将微量离心管插入冰浴中至少1MIN。 然后加入下列试剂的混合物：10×PCR BUFFER 2ΜL 25MM MGCL2 2Μ L 10MM DNTPMIX 1ΜL 0.1M DTT 2ΜL .轻轻混匀，离心。42℃孵育25MIN。 （3）加入SUPERSCRIPTⅡ1ΜL ，在42℃水浴中孵育50MIN。 （4）于70℃加热15MIN以终止反应。 （5）将管插入冰中，加入RNASE H 1ΜL ，37℃孵育20MIN，降解残 留的RNA。-20℃保存备用。
另：荧光PCR技术
实验原理
原理是：提取组织或细胞 中的总RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物 利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板 进行PCR扩增，而获得目 的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵 敏性提高了几个数量级， 使一些极为微量RNA样品 分析成为可能。
应用RT-PCR技术检测AFP在 转录水平上的的表达情况
通过RT-PCR技术，AFP的mRNA在反转 录酶的作用下，以mRNA为模版合成cDNA, 再以此cDNA为模版进行PCR反应
甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)
是肿瘤相关的胚胎特异α-球蛋白,分子量 约为70 kDa，是一直以来都被认为是临床诊 断胎儿出生缺陷和肝细胞癌的经典肿瘤标志物。
AFP基因的DNA结 构
AFP基因约为20 kbp大小, 由15 个内含子和14个外显子组成, 包 含590个氨基酸, 其中在N末端有 19个氨基酸是信号肽序列, AFP 蛋白质的分子量约70 kDa. AFP 被归类于白蛋白基因超家族, 这 个家族的结构特点为: 由半胱氨 基酸残基, 通过二硫键结合, 内折 成一个环, 形一个U形的3级结构 域. 这些分子, 通过晶体X-射线结 果确定都含有3个结构域。
注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免MRNA的断裂。 2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、Β-ACTIN（Β-肌动蛋白）等。其目的在于避 免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔 间的温度差等所造成的误差。 4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、 序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列 出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5． 防止DNA的污染： （1） 采用DNA酶处理RNA样品。 （2） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消 除基因和MRNA的共线性。
甲胎蛋白的基因序列
实验方法：
RT-PCR技术 RT- PCR（REVERSE TRANSCRIPTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION）即逆转录PCR， 是将RNA的反转录（RT）和CDNA的聚合酶链式扩 增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成 CDNA，再以CDNA为模板，扩增合成目 的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检 测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和 直接克隆 特定基因的CDNA序列。
3．PCR：
（1）取0.5ML PCR管，依次加入下列试剂： 第一链CDNA 2ΜL 上游引物（10PM） 2ΜL 下游引物（10PM） 2ΜL DNTP(2MM) 4ΜL 10×PCR BUFFER 5ΜL TAQ 酶（2U/ΜL） 1ΜL （2） 加入适量的DDH2O，使总体积达50ΜL。轻轻混匀，离心。 （3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保 证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参 （如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行 密度扫描。
试验技术路线
1、反转录酶的选择 2、合成cDNA引物的选择
3、试剂准备
4、操作步骤 5、注意事项
反转录酶的选择
1． MONEY 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强 的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温 度为37℃。 2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚 合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．THERMUS THERMOPHILUS、THERMUS FLAVUS等 嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在MN存在下，允许 高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNASE H突变体：商品名为 SUPERSCRIPT 和SUPERSCRIPTⅡ。此种酶较其它酶能 多将更大部分的RNA转换成CDNA，这一特性允许从 含二级结构的、低温反转录很困难的MRNA模板合成 较长CDNA。