应用RT-PCR技术检测AFP
分子生物学
增
。
实验 简介
实验 目的 实验 结果
用荧光定量PCR方法检测33例 肝癌及癌旁组织AFP mRNA表 达水平。。
实验 方法
33例肝癌组织和癌旁组织AFP mRNA 表达均阳性，肝癌组织 AFP mRNA 的 平均水平为 5.8110±0.9488 ，癌旁组 织 AFP mRNA 的 平 均 水 平 为 3.4432±0.4891
分子生物学讨论
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: NM_001134.1)的异常表达与肝 癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测 AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及 应用等。
材料与方法
病例选择及取材 收集住院确诊的原发性肝癌病人33例，年龄45
～ 65 岁，平均 56 岁。术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁 1cm 的 肝组织，迅速至-80℃冻存
引物、探针的设计合成 从Genebank中调出AFP的DNA和
RNA序列，根据引物设计原则，上游引物位于外显子1和2之间 ，序列为5-TGGAATAGCTTCCATATTGGGATTC－3‘，下游引 物位于外显子3上，序列为5’－ CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT－3’。
组织总RNA的提取
取冻存的肝癌组织及癌旁组织各约
0.1g，采用 Trizol （ Invitrogen 公司）提取组织的总 RNA ， 操作按说明进行。提取后的 RNA 测 A260-A280 吸光值，要 求A260/A280比值为1.8～2.0，并计算出RNA含量。
结论
肝癌组织AFP mRNA的平均水平 为5.8110±0.9488，
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法
甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法甲型肝炎（Hepatitis A）是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的急性肝炎疾病。
HAV主要通过食物或水源传播，感染者的粪便中含有病毒，当人们摄入被污染的食物或水时，病毒就会进入体内，导致感染。
甲型肝炎的临床表现多样，从无症状感染到轻度疾病，再到重度肝炎，甚至急性肝衰竭。
肝炎病毒核酸检测是甲型肝炎的确诊和病毒携带者的筛查方法之一。
核酸检测通过检测患者体液中的病毒核酸，来确定是否存在病毒感染。
以下是一些常用的甲型肝炎病毒核酸检测方法。
1. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实时荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的核酸检测方法，它可以检测到非常低浓度的病毒核酸。
该方法通过特定引物和探针与病毒核酸结合，产生荧光信号来检测病毒的存在。
RT-qPCR可以快速、准确地确定感染者的病毒载量，并监测病情的变化。
2. 反转录PCR（RT-PCR）反转录PCR是一种将RNA转录成DNA，然后进行PCR扩增的方法。
在甲型肝炎的检测中，RT-PCR可以将患者体液中的HAV RNA转录成HAV DNA，并进行扩增和检测。
这种方法对病毒的检测灵敏度高，可以用于早期感染的诊断。
3. 病毒载量测定病毒载量测定是通过定量检测患者体液中的病毒核酸来评估病情和治疗效果的方法。
常用的方法包括实时荧光定量PCR和RT-PCR。
病毒载量测定可以帮助医生判断感染的程度和预测病情的发展，对指导治疗和预后评估具有重要意义。
4. 其他检测方法除了核酸检测，甲型肝炎的诊断还可以通过检测血清中的抗HAV IgM抗体来确定。
这种方法可以检测到早期感染的抗体产生，但相对于核酸检测来说，其敏感度和特异性较低。
总结起来，甲型肝炎的肝炎病毒核酸检测方法包括实时荧光定量PCR、反转录PCR和病毒载量测定。
这些方法可以快速、准确地确定感染者的病毒载量和病情，对指导治疗和预后评估非常重要。
此外，抗HAV IgM抗体检测也可以用于早期感染的诊断，但其敏感度和特异性相对较低。
AFP临床应用及其检测
黄崇庭 2016.6.15于柳州
甲胎蛋白（AFP）
甲胎蛋白：
又称甲种胎儿球蛋白，甲型胎儿蛋白，是一种糖蛋白，属于白蛋白家族， 正常情况下，来自胚胎的肝细胞和卵黄囊，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液 中消失，正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克／升。
发现AFP：
由Bergstrand和Czar于1956年在胎儿血清中发现，而前苏联的Abelev则于1963 年发现AFP的来源主要为卵黄囊和胎盘；
（3）AFP具有促进细胞增殖的作用。
5、AFP在其他肿瘤中的应用
（1）各种源于内胚层的胃肠道肿瘤； （2）内胚窦瘤(卵黄囊瘤)； （3）生殖细胞癌等；
总结血清甲胎蛋白阳性增高的原因
随着病情恶化它在
肝癌
血清中的含量会
急剧增加
（阳性率80-90%）
孕妇; 其他肿瘤的肝转移
AFP阳性
急性肝炎 慢性肝炎 肝硬化
重型肝炎患者在发生肝细胞炎症坏死后能否有效的再生，与其预后有关，AFP 增高者，预后较好。
原因在于 （1）AFP能促进肝细胞生长因子受体表达, 从而促进肝细胞增殖、 分化、再生；
（2）AFP出现于有丝分裂旺盛的肝细胞和(或)幼稚肝细胞，在急性 病毒性肝炎、 活动性慢性乙型肝炎和肝硬化时, AFP升高标志肝 细胞再生活跃；
AFP目前的检测方法
1、化学发光免疫分析( CLIA) 是采用现代全自动仪器操作控制，单克隆抗体标记发光物质吖啶酯或碱性磷
酸酶促化学发光最新的微磁粒子标记反应的技术，是光的高灵敏性、单克隆抗体 高特异性结合的自动化、智能化程序的现代免疫定量技术。目前以电化学发光免 疫分析为代表，实现了免疫测定的自动化，具有测定结果稳定、线性范围宽、测 定速度快、试剂保存期长等优点，但检测成本高。
rtpcr的作用
rtpcr的作用什么是rtpcrrtpcr（全称为逆转录聚合酶链反应，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种基因检测技术，可以用于检测RNA分子在样本中的存在并量化。
rtpcr的原理rtpcr技术基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过逆转录将RNA转化为反义DNA （cDNA），然后使用一对特定的引物（primers）扩增目标基因的DNA片段。
逆转录过程中，逆转录酶将RNA模板反向转录合成cDNA，在PCR反应中，DNA聚合酶通过引物将cDNA扩增成大量的DNA。
这个过程可以使我们检测到RNA分子的存在，并量化RNA的数量。
rtpcr的应用rtpcr技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，特别是在疾病的诊断和治疗中起着重要作用。
1.病原体检测：rtpcr可以检测感染性疾病的病原体，如病毒和细菌。
通过扩增病原体酸核酸的特定片段，可以快速准确地诊断出病原体感染。
2.基因表达分析：rtpcr可以评估基因在不同组织或细胞中的表达水平。
通过对比不同样本中目标基因的表达差异，可以研究基因在生理和病理过程中的调控机制。
3.肿瘤检测：rtpcr可以检测肿瘤标志物，通过扩增患者体液或组织中的肿瘤相关基因，可以及早诊断出肿瘤，进行早期治疗。
4.遗传疾病诊断：rtpcr可以检测遗传疾病的突变基因，帮助医生确定患者是否携带致病基因，并进行遗传咨询和干预。
5.药物研发：rtpcr可以评估药物对特定基因的调控作用，在新药研发中有着重要的应用价值。
rtpcr的优势和局限性rtpcr技术相比传统的基因检测方法具有以下优势：•高灵敏度：可以检测到非常低浓度的目标RNA，并能够量化RNA的表达水平。
•高特异性：通过引物的设计，可以选择性地扩增目标基因，减少误报率。
•高准确性：可以重复多次扩增同一样本，并获得可重复的结果。
然而，rtpcr技术也存在一些局限性：•需要引物设计：需要针对目标基因设计特异引物，这对于一些未知基因或变异较多的基因可能存在困难。
甲胎蛋白(AFP)测定(化学发光法)
4 操作步骤
1 开机前检查
a 察看电源是否正常安全通电
b 推主机下部的前门，打开后检查洗净水与分注液的用量是否满足当日
用量废试样杯与废吸嘴是否丢弃
2 开机
a更换75%酒精，放置基质液
b 打开电脑主机及AIA-1800电源, 点击主业面进入root
c 试样吸嘴的设置及酶标识试剂，检体稀释液的设置，按主机操作版面
Reagent/Tip键，LED指示灯变为绿色，打开试剂吸嘴护罩，将酶
标识试剂，检体稀释液设置在试剂托架上，将条形码
标识面朝前
d 试剂杯的设置，按主机操作版面的Cup Sorter键，LED指示灯
变为绿色，拉开分类器抽屉将试剂托盘设置在分类器托盘上，将分类器
抽屉推到底
3 开机日检
4 日检通过后，进行标本检测，在树形菜单上进入界面设置标
本检测项目，Assay键点击开始测定
5 测定完毕后，按主机操作版面的Cup Sorter及Reagent/Tip键，LED指
示灯变为绿色，打开试剂吸嘴护罩及分类器抽屉，收集试剂放入冰箱，
更换基质液，放置75%酒精
6 点击关机，待窗口消失，关闭AIA-1800电源，在关闭电脑及主电
源
5 质量控制：
每批试剂都要使用东曹公司标准品作质量控制，请参见AIA-1800仪器操作手册。
AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达.
AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达【摘要】【目的】构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体，并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析。
【方法】采用PCR法扩增人AFP基因启动子。
回收纯化后克隆入pBluescript II KDR-TK相同克隆位点，切取AFP-TK片段，然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中，构建成pEGFP-C1-AFP-TK。
对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定。
【结果】序列分析表明，该启动子含300 bp核苷酸，与已报道的序列比较，100%相符。
限制性酶切分析，重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子。
RT-PCR及Western blotting分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后，表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达，裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61 ～ 83 ku大小的特异性条带。
【结论】人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK 构建成功。
【关键词】 AFP启动子; HepG2细胞; 靶向表达; 单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶1Abstract：【Objective】 To construct the herpes simplexvirus thymidine kinase type 1(HSV-1-TK) expression vector with alpha- fetoprotein (AFP) expression gene as starter， and analyzing its specific expression. 【Method】 The AFP promoter was amplified by means of PCR. It was purified and cloned on the cloning site of pBluescript II KDR-TK. Then the AFP-TK， fragment was obtained and inserted into pEGFP-C1 with T4 DNA ligase. The obtained fragment was identified for its cell targeting and exogenous genes expression. HepG2 genome DNA was extracted as template to amplify the AFP sequence (300 bp). Its PCR product was then conjugated with pMD-18，then amplified and extracted. The pMD-18-AFP was digested， and then the fragment was cloned into pBluescriptII KDR-TK. Then to produce the whole expressing fragment of AFP-TK which was inserted into the pEGFP-C1. Then the construction of pEGFP-C1-AFP-TK finished. The gene product was sent for sequencing evaluation. And the expression of pEGFP-C1-AFP-TK in HepG2 cells and ECV 304 cells was evaluated. And its mRNA expression was also evaluated. 【Result】 The sequence analysis proved that the promoter contained 300 bp nucleic acid which was 100% consistency with literatures. The result of restriction endonuclease analysis demonstrated that the recombined pEGFP-C1-AFP-TK was cloned within the AFP as an AFP promoter. The results of RT-PCR and Western blotting from the HepG2 cells transfected with pEGFP-C1-AFP-TK demonstrated that TK mRNA was expressed effectively. The lysis from the HepG2 cells was a specific band of 61-83 ku. ThepEGFP-C1-AFP-TK was transcripted in HepG2 cells and expressed inHepG2 mRNA effectively. 【Conclusion】 The plasmid of pEGFP-C1-AFP-TK specific for HepG2 cells was successfully constructed.Key word： alpha-fetoprotein promoter; HepG2 cells; targeting expression; herpes simplex virus thymidine kinase type 1[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(5)：591-594]蛋白转移到硝酸纤维膜上。
甲胎蛋白基因
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从翻译水平检测AFP的表达情况。
实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。
实验目的•1、复习基因表达检测的几种方法•2、探究AFP的异常表达与恶性肿瘤的关系基因表达检测方法•1、转录水平：RT-PCR，real-time PCR，northern blot •2、翻译水平：western blot•3、直接检测：报告基因、融合荧光蛋白等•PS：RT-PCR是反转录PCR，是半定量方式。
real-time PCR可以精确定量。
二者不同。
后者为了区别于RT-PCR，一般不缩写。
Western Blot•生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。
根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
•检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于•500微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。
不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。
AFP检测的临床意义及生物学作用研究新发现
AFP检测的临床意义及生物学作用研究新发现张国英1综述梁建芳2赵龙凤2审校1.长治医学院传染病学教研室2.山西医科大学传染病学教研室摘要：AFP作为一种肿瘤标志物，已被广泛用于原发性肝癌(HCC)的诊断，其检测方法和检测内容也不断完善。
近年来，人们发现它对肿瘤细胞增殖和发展有重要生物学作用。
关键词 AFP 检测 肿瘤细胞增殖 生物学作用早在1944年已有人对甲胎蛋白的存在进行过研究，但直到1965年美国科学家Bergstyandh和Czar才观察到2例原发性肝癌患者血清能与抗胎儿血清的单价抗血清起反应，说明原发性肝癌患者血清中与人类胎儿血清中有一共同的特殊成分，并将这种特殊的蛋白成分称为甲种胎儿球蛋白（alpha-fetoprotein或α-fetoprotein, AFP或afp）。
此后的研究发现这种蛋白在18种哺乳类动物之间有交叉反应。
长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌(HCC)的诊断指标之一。
近年来，人们除了对其异质体在诊断中的价值进行探讨外，还对它在肿瘤细胞增殖和凋亡方面的作用进行了系列研究，进一步阐述了AFP的生物学活性及临床意义，现综述如下。
1.AFP的来源及生化特性1.1AFP的来源及基因表达调节AFP的合成部位主要是在啮齿动物及人类胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道等。
它是啮齿类动物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。
人类胚胎在子宫内发育的第六周左右用双向扩散法即能测出AFP，到第13周左右可达到高峰，第16周后AFP的浓度迅速下降而白蛋白浓度上升。
在人类胚胎中AFP最高浓度可达3—4mg/ml，但新生儿期其血清浓度约为10－50ug/ml，出生后第1周末用双向扩散法即不再能测出［1］。
然而，在正常成人的血清中，AFP基因表达并未完全关闭。
用敏感的方法可以检测到低浓度AFP的可持续存在。
有人用硫酸铵沉淀法RIA检测献血员11例，8例AFP在10ng/ml以下。
AFP临床应用及其检测
AFP临床应用及其检测AFP临床应用及其检测1. 简介AFP（Alpha-fetoprotein），又称甲胎蛋白，是一种在胎儿中产生的蛋白质。
AFP在正常情况下在胎儿怀孕期间被产生，然后在出生后迅速下降至低水平。
然而，在一些疾病状态和恶性肿瘤中，AFP的水平会显著升高。
因此，AFP检测在临床中被广泛应用于早期肿瘤筛查和肝癌、睾丸癌等疾病的诊断和监测。
2. AFP检测方法2.1 血清AFP测定血清AFP测定是最常用的检测方法之一。
通过血液样本中的酶免疫化学发光法（ECLIA）或免疫层析法等技术手段，测定血清中的AFP浓度。
结果可快速得出，具有简便、快速、非侵入性等优点。
2.2 妊娠前诊断在孕妇妊娠期间，AFP水平的异常变化可以用于妊娠并发症的早期筛查，如神经管缺陷等。
妊娠期AFP的检测常通过血清AFP测定或羊水中的AFP测定实现。
2.3 肝癌检测与诊断AFP的水平在肝癌患者的血清中常常升高。
因此，在高危人群中的AFP检测常用于早期肝癌的筛查和诊断。
结合其他检测指标如肝功能、超声、磁共振等，能提高肝癌的检测准确性。
2.4 睾丸癌检测与监测AFP的水平在睾丸癌患者的血清中往往升高。
AFP的检测可以用于睾丸癌的早期诊断、疗效评估和预后监测。
3. AFP检测的临床应用3.1 肿瘤筛查AFP的测定常用于肿瘤筛查，旨在早期发现和诊断肝癌、睾丸癌等恶性肿瘤。
3.2 肝癌患者的监测AFP的水平可以用于监测肝癌患者的疗效和复发情况。
通过定期检测AFP，可以及早发现疾病的进展和复发。
3.3 妊娠并发症筛查AFP的检测可以用于早期筛查妊娠期间的并发症，如神经管缺陷等。
4. 附件本文档涉及下列附件：- 附件1：AFP检测结果表格样本- 附件2：AFP测定方法详细说明5. 法律名词及注释- AFP（Alpha-fetoprotein）：甲胎蛋白的英文缩写，是一种在胎儿和少数成人中产生的蛋白质。
- ECLIA（Electrochemiluminescence Immunoassay）：酶免疫化学发光法，是一种常用于血清AFP测定的技术手段。
《2024年在原发性肝癌诊断中单独及联合检测AFP、AFU、CA199、GPC3的研究》范文
《在原发性肝癌诊断中单独及联合检测AFP、AFU、CA199、GPC3的研究》篇一一、引言原发性肝癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤之一，具有发病率高、恶性程度强的特点。
近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，原发性肝癌的发病率呈现出持续上升的趋势。
早期诊断是肝癌治疗成功的关键，因此，寻找有效的肿瘤标志物对于提高肝癌的诊断率具有重要意义。
本文旨在研究在原发性肝癌诊断中单独及联合检测AFP（甲胎蛋白）、AFU（α-L-岩藻糖苷酶）、CA199（癌胚抗原）和GPC3（甘胆酸蛋白3）的效果。
二、材料与方法1. 研究对象本研究选取了XX家医院收治的疑似原发性肝癌患者作为研究对象，共收集了XX例患者的临床资料。
2. 检测方法（1）AFP检测：采用电化学发光法进行检测。
（2）AFU检测：采用酶联免疫吸附试验进行检测。
（3）CA199检测：采用免疫化学发光法进行检测。
（4）GPC3检测：采用实时荧光定量PCR技术进行检测。
（5）联合检测：将上述四种肿瘤标志物进行组合，对患者进行联合检测。
三、结果1. 单独检测结果AFP、AFU、CA199和GPC3在原发性肝癌患者中的阳性率分别为XX%、XX%、XX%和XX%。
其中，AFP和GPC3的阳性率较高，而AFU和CA199的阳性率相对较低。
然而，四种肿瘤标志物的敏感性和特异性因患者病情、肿瘤大小等因素而异。
2. 联合检测结果联合检测四种肿瘤标志物可以提高原发性肝癌的诊断率。
与单独检测相比，联合检测的阳性率、敏感性和特异性均有所提高。
其中，AFP与GPC3的联合检测效果最佳，能够显著提高诊断的准确性和可靠性。
四、讨论AFP作为传统的肝癌肿瘤标志物，在原发性肝癌的诊断中具有一定的价值。
然而，其敏感性和特异性受多种因素影响，如患者病情、肿瘤大小等。
AFU、CA199和GPC3等新型肿瘤标志物的发现为肝癌的诊断提供了更多的选择。
本研究表明，联合检测这四种肿瘤标志物可以显著提高原发性肝癌的诊断率。
afp检测实验报告
afp检测实验报告AFP检测实验报告引言：AFP（α-胎蛋白）是一种胚胎发育过程中产生的蛋白质，它在正常情况下主要存在于胎儿的肝脏和消化系统中。
然而，AFP的异常水平与多种疾病的发生和发展密切相关。
本实验旨在通过检测AFP水平，探究其在疾病诊断中的潜在价值。
实验设计：本实验采用了血清样本来测定AFP的水平。
首先，我们收集了一组健康人群的血清样本作为对照组，然后收集了一组患有肝癌的患者的血清样本作为实验组。
接下来，我们使用特定的实验方法来测定每个样本中AFP的含量，并对结果进行统计分析。
实验结果：通过对血清样本的检测，我们发现实验组中AFP的平均水平明显高于对照组。
具体来说，对照组的AFP水平平均为X ng/mL，而实验组的AFP水平平均为Y ng/mL。
这一结果表明，AFP的水平与肝癌的发生和发展之间存在着密切的关联。
讨论：AFP作为一种肿瘤标志物，在肝癌的诊断和预后评估中具有重要的临床意义。
高水平的AFP常常与肝癌的存在和进展相关，因此，AFP的检测可以作为肝癌筛查和早期诊断的一种重要手段。
然而，需要指出的是，AFP的水平受到多种因素的影响，包括年龄、性别和肝疾病等。
因此，在进行AFP检测时，需要结合其他临床指标进行综合评估。
此外，AFP的检测不仅适用于肝癌的诊断，还可以用于其他疾病的筛查和监测。
例如，AFP的异常水平也与胎儿神经管缺陷（如脊柱裂）和胎盘功能不全等相关。
因此，AFP的检测在产前保健中也具有一定的应用价值。
结论：通过本实验的结果，我们得出了AFP在肝癌诊断中的重要性以及其在其他疾病筛查中的潜在应用价值。
然而，需要注意的是，AFP的水平受到多种因素的影响，因此，在进行AFP检测时，需要综合考虑其他临床指标。
希望本实验的结果能够为相关领域的研究和临床实践提供一定的参考。
未来展望：尽管AFP的检测在肝癌和其他疾病的诊断中具有一定的应用价值，但仍有一些问题需要进一步研究。
例如，如何提高AFP的检测准确性和灵敏度，如何确定不同人群的正常AFP水平范围等。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法1.免疫比浊法：这是一种常见的甲胎蛋白测定方法，其基本原理是利用抗甲胎蛋白抗体与体液中的AFP结合，并通过免疫反应形成比浊溶液。
在一定条件下，通过比较反应溶液的滴度与标准质量的AFP溶液的滴度，即可计算出待测样品中的AFP浓度。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）：这种方法是在固相酶联免疫吸附试验的基础上改进的。
首先，将待测样品加入带有特异抗体的酶标板孔中，与抗体发生特异性结合。
然后，通过洗涤去除未结合的物质，并加入与甲胎蛋白结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
最后，加入底物使酶催化发生显色反应，根据反应物浓度与显色强度的相关性计算出AFP的浓度。
3.免疫电泳法：免疫电泳法通过将待测样品与抗甲胎蛋白抗体混合，然后将混合物分离电泳，以检测AFP的浓度。
根据电泳后蛋白质条带的长度和强度，可以判断AFP的浓度高低。
4. Immuno-Polymerase Chain Reaction（IPCR）：这是一种新兴的甲胎蛋白测定方法。
它结合了免疫技术和聚合酶链反应（PCR）技术。
首先，通过PCR扩增样品中的AFP基因片段。
然后，采用特异性抗体结合PCR扩增产物，形成固定复合物。
最后，通过荧光素酶或放射性示踪剂对复合物进行检测，计算待测样品中AFP的浓度。
以上是目前常见的AFP测定方法，每种方法都有其优点和局限性。
选择合适的方法应根据实际需要、设备条件和诊断要求。
甲胎蛋白的测定方法对于一些疾病的早期诊断和治疗监测具有重要意义，然而，需要注意的是，单纯的AFP测定结果并不能作为其中一种疾病的确诊依据，还需要结合其他临床信息进行综合分析和判断。
肿瘤标志物检测原理
肿瘤标志物检测原理 Prepared on 22 November 2020肿瘤标志物检测原理根据WHO资料，全球范围内恶性肿瘤是人类仅次于心脑血管病的第二大死亡原因，占总死亡人数的22%，并逐年增加。
10种常见肿瘤：胃癌、肝癌、食管癌、结直肠肛门癌、白血病、子宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌和膀胱癌。
肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗是患者获得长期生存的最主要途径。
以肝癌为例，肿瘤直径＜2cm，5年生存率几乎100%；直径每增加1cm，5年生存率下降20%。
肿瘤诊断三大支柱是图像诊断（包括B超、CT、核磁共振）、化学诊断（血清学和免疫学）及细胞学和组织学诊断，而后两者均以肿瘤标志为主要或辅助观察指标。
当前，肿瘤标志物的检测已从细胞水平深入到分子基因水平，在检测技术上，它将生物化学、核医学、免疫学、细胞学、病理学、分子生物学等诸多学科融合在一起，不仅使检测的项目有了大幅度的增加，而且检测的特异性和灵敏度也有很大的提高。
肿瘤标志物在肿瘤诊断，检测肿瘤复发与转移，判断疗效和预后以及人群普查等方面都有较大的实用价值，而且在肿瘤发生和发展机理研究中也具有重要作用。
肿瘤标志物除用于肿瘤诊断外，可为临床肿瘤治疗提供依据及以其为靶，进行肿瘤的靶向治疗及免疫治疗。
肿瘤标志学已成为肿瘤学中一个重要的新学科、新领域。
肿瘤标志（Tumour Markers）是1978年Herberman在美国国立癌症研究所（NCI）召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断”会上提出的，次年在英国第七届“肿瘤发生生物学和医学”会议被大家确认，并开始引用。
肿瘤标志物是指由肿瘤细胞由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质，这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中，进入到血液或其他体液或组织中，或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到血液或体液或组织中而含量明显高于正常参考值的一类生物活性物质。
不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。
荧光定量RT-PCR检测AFPmRNA基因表达
AFPM基因简介
AFPM基因是一种编码脂肪酸代谢相 关蛋白的基因，其在脂肪酸代谢过程 中起着关键作用。
AFPM基因的表达水平与多种疾病的 发生和发展密切相关，因此检测 AFPM基因的表达水平对于疾病的诊 断和治疗具有重要意义。
逆转录反应
将提取的RNA与逆转录酶、引物和必 要的缓冲液混合，进行逆转录反应， 合成cDNA。
数据处理与分析
采用适当的软件对荧光定量PCR数据 进行处理和分析，计算目标基因的表 达量，并进行统计学分析。
实验方法
RNA提取
采用适当的方法从细胞系或组织样本 中提取总RNA，如Trizol法或磁珠法。
荧光定量PCR
详细描述
研究发现，AFPM基因的表达水平与其他多 个基因的表达水平存在关联性。这些基因涉 及到细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个 生物学过程。这表明AFPM基因的表达水平 与细胞生命活动密切相关，可能在多个生物
学过程中发挥重要作用。
AFPM基因与其他基因关联性分析
总结词
AFPM基因的表达水平与其他基因的表达水 平存在关联性。
研究发现，AFPM基因的表达水平与患者的疾病进展和预 后存在明显的相关性。高表达AFPM基因的患者通常具有 较好的预后，而低表达AFPM基因的患者则预后较差。这 表明AFPM基因的表达水平可以作为疾病进展和预后的预 测指标。
AFPM基因与其他基因关联性分析
总结词
AFPM基因的表达水平与其他基因的表达水 平存在关联性。
通过荧光染料或探针标记的特异性引物，实现对目标基因的定量检测，具有较高的准确性和可重复性 。
应用组织特异性分子的保守序列鉴定人源细胞的组织来源
应用组织特异性分子的保守序列鉴定人源细胞的组织来源孙昊;刘玉琴;卞晓翠;杨振丽;赵晓梅【摘要】目的建立一种有效简便经济的检测方法,用于鉴定培养细胞的组织来源,对新鲜取材细胞归类,检测细胞组织来源.方法根据文献报道与NCBI数据库,设计17对组织特异性相关引物,分别针对16个常见的人类组织特异性因子的mRNA保守序列,培养细胞,提取mRNA,反转录为cDNA,以此为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳分析;对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;其中8对引物可用于判断人类组织特异性,以双肓实验对此方法进行验证,用于鉴定人类细胞的组织来源.结果 17对组织特异性相关引物中,特异性分子ALB、AFP、SYN、CDH16、SFTPB、LCA、FLT 和MUL2的对应引物可有效应用于鉴定细胞是否源自肝、肾、神经、肺、造血、内皮和分泌组织;特异性因子PSA对应引物可广泛在人类各组织细胞中扩增出条带;鉴定其他组织的引物有待进一步研究完善优化.结论应用反转录聚合酶链式反应扩增编码组织特异性分子mRNA的保守序列可以准确鉴定待检测细胞的组织来源.本研究为鉴定常见细胞的组织来源提供新方法.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)006【总页数】8页(P802-809)【关键词】组织特异因子;细胞;组织起源【作者】孙昊;刘玉琴;卞晓翠;杨振丽;赵晓梅【作者单位】中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心,北京100005;中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心,北京100005【正文语种】中文【中图分类】R-331体外培养的实验细胞资源是目前医学与生命科学领域应用最广泛、最重要的实验工具之一，使用背景清楚的细胞是实验可靠的关键。
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试剂准备 1．RNA提取试剂 2．第一链CDNA合成试剂盒
3．DNTPMIX：含DATP、DCTP、DGTP、 DTTP各2MM 4．TAQ DNA聚合酶
1. 总RNA的提取 2. CDNA第一链的合成：
（1）在0.5ML微量离心管中，加入总RNA 1-5ΜG，补充适量的DEPC H2O使总体积达11ΜL。在管中加10ΜM OLIGO（DT）12-18 1ΜL，轻 轻混匀、离心。 （2）70℃加热10MIN，立即将微量离心管插入冰浴中至少1MIN。 然后加入下列试剂的混合物：10×PCR BUFFER 2ΜL 25MM MGCL2 2Μ L 10MM DNTPMIX 1ΜL 0.1M DTT 2ΜL .轻轻混匀，离心。42℃孵育25MIN。 （3）加入SUPERSCRIPTⅡ1ΜL ，在42℃水浴中孵育50MIN。 （4）于70℃加热15MIN以终止反应。 （5）将管插入冰中，加入RNASE H 1ΜL ，37℃孵育20MIN，降解残 留的RNA。-20℃保存备用。
另：荧光PCR技术
实验原理
原理是：提取组织或细胞 中的总RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物 利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板 进行PCR扩增，而获得目 的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵 敏性提高了几个数量级， 使一些极为微量RNA样品 分析成为可能。
3．PCR：
（1）取0.5ML PCR管，依次加入下列试剂： 第一链CDNA 2ΜL 上游引物（10PM） 2ΜL 下游引物（10PM） 2ΜL DNTP(2MM) 4ΜL 10×PCR BUFFER 5ΜL TAQ 酶（2U/ΜL） 1ΜL （2） 加入适量的DDH2O，使总体积达50ΜL。轻轻混匀，离心。 （3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保 证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参 （如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 （4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。 （5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行 密度扫描。
注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免MRNA的断裂。 2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、Β-ACTIN（Β-肌动蛋白）等。其目的在于避 免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔 间的温度差等所造成的误差。 4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、 序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列 出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。 5． 防止DNA的污染： （1） 采用DNA酶处理RNA样品。 （2） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消 除基因和MRNA的共线性。
应用
1、分析基因的转录产物
2、获取目的基因
3、合成cDNA探针 4、构建RNA高效转录系统
试验技术路线
1、反转录酶的选择 2、合成cDNA引物的选择
3、试剂准备
4、操作步ห้องสมุดไป่ตู้ 5、注意事项
反转录酶的选择
1． MONEY 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强 的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温 度为37℃。 2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚 合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．THERMUS THERMOPHILUS、THERMUS FLAVUS等 嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在MN存在下，允许 高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNASE H突变体：商品名为 SUPERSCRIPT 和SUPERSCRIPTⅡ。此种酶较其它酶能 多将更大部分的RNA转换成CDNA，这一特性允许从 含二级结构的、低温反转录很困难的MRNA模板合成 较长CDNA。
应用RT-PCR技术检测AFP在 转录水平上的的表达情况
通过RT-PCR技术，AFP的mRNA在反转 录酶的作用下，以mRNA为模版合成cDNA, 再以此cDNA为模版进行PCR反应
甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)
是肿瘤相关的胚胎特异α-球蛋白,分子量 约为70 kDa，是一直以来都被认为是临床诊 断胎儿出生缺陷和肝细胞癌的经典肿瘤标志物。
AFP基因的DNA结 构
AFP基因约为20 kbp大小, 由15 个内含子和14个外显子组成, 包 含590个氨基酸, 其中在N末端有 19个氨基酸是信号肽序列, AFP 蛋白质的分子量约70 kDa. AFP 被归类于白蛋白基因超家族, 这 个家族的结构特点为: 由半胱氨 基酸残基, 通过二硫键结合, 内折 成一个环, 形一个U形的3级结构 域. 这些分子, 通过晶体X-射线结 果确定都含有3个结构域。
甲胎蛋白的基因序列
实验方法：
RT-PCR技术 RT- PCR（REVERSE TRANSCRIPTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION）即逆转录PCR， 是将RNA的反转录（RT）和CDNA的聚合酶链式扩 增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成 CDNA，再以CDNA为模板，扩增合成目 的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检 测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和 直接克隆 特定基因的CDNA序列。