黄酮类成分分析..

游离黄酮类化合物的检识，一般宜用醇性展开剂；花色素及花色 苷的检识可用含盐酸或乙酸的水溶液作展开剂。
多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外灯检查时，可以看到有色点， 以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外，还可以喷以2%AlCl3 甲醇溶液（在紫外灯下检查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液 等显色剂。
§2 黄酮类成分分析
一、结构特征及理化性质

结构特征
基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）
O

理化性质
物理性状
O
结晶性固体或无定形粉末。大多数呈黄色，其颜色的有无与交叉共 轭体系有关。如：黄酮、黄酮醇及其苷类多呈黄色；二氢黄酮、二 氢黄酮醇及黄烷醇呈无色；异黄酮呈无色或微黄色。 溶解性
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Hale Waihona Puke Baidu色谱法
1.薄层色谱法 硅胶--分离鉴别弱极性黄酮类化合物 • 遵循正相色谱原理，化合物极性越大，所选择的展开剂极性也 相应增大，同时根据化合物酸性强弱调节展开剂的酸碱性。常 用展开剂有苯-甲醇等。 聚酰胺--分离检识含游离酚羟基的黄酮及其苷 • 利用氢键吸附原理，由于聚酰胺和黄酮类化合物上酚羟基形成 氢键缔合，所以作用力较强，需要极性强的展开剂，而在展开 剂中大多含有醇、酸或水，或兼有两者。所以，分离检识游离 黄酮常用有机溶剂作为展开剂，如氯仿- 甲醇等；而分离检识黄 酮苷常用含水有机溶剂作为展开剂，如甲醇- 水等。 纤维素--分离黄酮类多糖苷混合物 • 展开系统：正丁醇-乙酸-水，5%~40%乙酸 展开好的色谱，常在紫外灯（365nm）下观察荧光斑点及其颜 色；亦可喷三氯化铝试剂，在日光灯或紫外灯下观察荧光是否加 强；也可氨熏，是否出现黄色、棕色荧光斑点等。
三、含量测定
中药制剂中含有黄酮类成分，可按要求测定总黄酮含量、黄酮类单
体含量或两者均须测定。含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、 高效液相色谱法等。
（一）、总黄酮含量测定
分光光度法一般用于总酮类成分的含量测定。大多数黄酮类化合 物在甲醇溶液中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。 带Ⅰ—出现在300~400nm之间的吸收带 带Ⅱ—出现在240~285nm之间的吸收带 含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经必要的提取纯化后，可直接 于最大吸收波长附近测定总黄酮的吸光度，对照品的选定应以最大吸收 波长与总黄酮的相近为原则，单体黄酮和总黄酮均可作为对照品，常以 芦丁等对照品计算总黄酮的含量。 毛冬青注射液中黄酮苷的测定（书P132）
2.纸色谱法 适用于分离各种类型的黄酮化合物，包括游离黄酮和黄酮苷类。 混合物的检识常采用双向色谱法，第一向采用醇性展开剂如正丁醇 -乙酸-水（4:1:5上层，BAW）等，此为正相分配色谱，极性小的化合 物比极性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展开剂，如水、 2%~6%乙酸等，其色谱行为类似于反向色谱，极性大的化合物比极 性小的化合物Rf值大。
银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定
[含量测定]色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。理 论板数按槲皮素峰计算应不低于2500，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离度 应大于1.5。 对照品溶液的制备（略） 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约相 当于总黄酮醇苷19.2mg的粉末，精密称定，精密加入甲醇20ml，称定重量， 超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤 过，精密量取续滤液 10ml，置100ml锥形瓶中，加甲醇10ml、25%盐酸溶 液5ml，摇匀，置水浴中加热回流 30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μ m）滤过，取滤 液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ l，注入液相色谱 仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，按下式换算成总 黄酮苷的含量。 总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量）×2.51
二、鉴别

化学反应法
还原反应 盐酸镁粉反应— 鉴定黄酮类常规反应 钠汞齐还原反应 四氢硼钠还原反应— 专属性较高 专门鉴别二氢黄酮、二氢黄酮醇与其它黄酮类区别 与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐） • 三氯化铝反应— 鉴别邻二酚羟基 • 锆盐-枸橼酸反应— 鉴别黄酮类化合物中是否存在3-羟基或5羟基 • 氨性氯化锶反应— 邻二酚羟基主要反应 • 三氯化铁反应— 酚羟基主要反应 硼酸显色反应— 5-羟基黄酮或6’-羟基查耳酮主要反应 碱性试剂反应 五氯化锑反应— 鉴别查耳酮 Gibb’s反应和Emerson反应— 鉴别黄酮类化合物酚羟基对位 上是否被取代
（二）、单体黄酮含量测定

薄层扫描法
样品经适宜的溶剂提取得到供试液，经硅胶、聚酰胺或纤维素薄层
色谱有效分离后，用薄层扫描仪直接进行含量测定。对黄酮类单体


既可以进行紫外-可见光扫描，又可以进行荧光扫描。 高效液相色谱法 正相色谱(多用于没有羟基或乙酰化黄酮类成分化合物） 固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。 • 反相色谱（C18或C8） 固定相多为十八烷基硅烷键合相 流动相：甲醇-水-乙酸（磷酸缓冲液），乙腈-水 检测器：紫外检测器或荧光检测器 心通口服液中葛根素的含量测定（书P133）
游离苷元—易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶及稀碱水 黄酮苷—易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂
酸碱性
酸性：与酚羟基的数目和位置有关 7,4’- 二羟基> 7或4’- 羟基> 一般酚羟基> 5-羟基 碱性：r-吡喃酮环上的1-位氧原子，可表现出微弱碱性 显色反应 还原反应（盐酸镁粉反应） 与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐） 硼酸显色反应碱性试剂反应 五氯化锑反应 Gibb’s反应和Emerson反应 光谱特征 I带(300-400nm) →B环桂皮酰基 II带(240-285nm) →A环苯甲酰基