常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征致病基因的突变分析

2 个家系发现有 PINK1 基因纯合突变。家系 13 外显子 4 第 938 位碱基 C→T 的改变（C938T） (图 3,A;图 2,C)，导致第 313 位氨基酸由苏氨酸变为蛋氨酸（T313M）；家系 19 外显子 7 第 1474 位碱基 C 被 T 替换（C1474T）(图 3,B)，导致第 492 位氨基酸由精氨酸变为终止密码子 （R492Stop），截短了后面 90 个氨基酸。
3.2 临床资料分析： 三个 PARK2 家系共 6 名患者，男女各 3 例，发病年龄 18~31 岁，平
均（25.2±5.7）岁，病程（7.2±1.8）年；均有静止性震颤、肌强直、运动迟缓及症状晨 轻暮重，肌张力障碍、姿势不稳、腱反射活跃常见，对左旋多巴反应好，服药后 UPDRS 运动 评分平均为（23.5±4.8）分，左旋多巴诱导的运动障碍常见。两个 PARK6 家系共有 4 名患 者，男女各 2 例，发病年龄 13～37 岁，平均（25.8±10.0）岁，病程（11.0±3.2）年；临 床症状与 PARK2 型相似，但未见肌张力障碍及姿势不稳，对左旋多巴反应更好，服药后 UPDRS 运动评分平均为（7.5±3.4）分，未见多巴诱导的运动障碍。临床特征见表 1。
A ：家系 15 的 parkin 基因外显子 9 酶切图，（1:Marker；2:Ⅰ1；3:Ⅰ2；4:Ⅱ2；5:Ⅱ3； 6:Ⅱ1）；
B ：家系 1 的 parkin 基因外显子 12 酶切图，（1:Marker；2:Ⅰ1；3:Ⅰ2；4:Ⅱ1；5:Ⅱ2； 6:对照）；
C ：家系 13 的 PINK1 基因外显子 4 酶切图，（1:Marker；2:Ⅰ2；3:Ⅱ1； 4:Ⅱ2；5:Ⅱ4,； 6:Ⅱ5） 图 2 限制性核酸内切酶酶切图
【关键词】帕金森病；常染色体隐性遗传； 基因； 突变
1. 引言
帕金森病是一种包括临床、病理和发病机制各异、由多种亚型组成的神经退行性疾病。 其 中 ， 常 染 色 体 隐 性 遗 传 早 发 性 帕 金 森 综 合 征 （ autosomal recessive early-onset parkinsonism, AREP）有三种基因型：PARK2，PARK6 和 PARK7；致病基因均已被克隆，分别 是 parkin，PINK1 和 DJ-1 基因[1、2、3]。这三型临床特征极为相似：发病年龄早（一般小于 40 岁），病情进展缓慢，对多巴制剂反应良好等，在临床上容易混淆；而且，由于发病年 龄早，某些临床特点，如发病时有足部肌张力障碍、症状晨轻暮重等，与多巴反应性肌张力 障碍（DRD）很难鉴别[4]。因此对 AREP 进行基因诊断极为必要。为此，我们对 15 个 AREP 家 系进行了 parkin，PINK1，DJ-1 基因和 DRD 致病基因—酪氨酸羟化酶（TH）基因的突变分析。
胺凝胶电泳（PAGE）检测后，对异常条带进行回收，对特异性好的产物用虾碱性磷酸酶和核 酸外切酶消化，条件为：37℃ 60min，80℃ 15min,4℃保存。回收或酶切产物在 ABI3100 测序仪上直接正反向测序，将测序结果与 GenBank 中相应的基因序列比较。
2.6 限制性核酸内切酶分析 Parkin 基因外显子 9 的 1069-1074delGTGTCC 的改变使 Pst Ⅰ酶切位点消失，外显子 12 的 T1422C 碱基改变产生了一个 HhaⅠ酶切位点；PINK1 基因外
图 1 parkin 基因第二、九和十二外显子测序结果
上图 正常对照； 下图 患者 A: 家系 13 先证者外显子 4 的 C938T 改变 B: 家系 19 先证者外显子 7 的 C1474T 改变 图 3 PINK1 基因第四和第七外显子测序结果
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参考文献
1 Kitada T, Asakawa S, Hattori N, et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism.Nature,1998,392:605-608.
2 Valente EM, Abou-Sleiman PM, Caputo V, et al. Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK1. Science,2004,304:1158-1160.
目前已发现 PINK1 基因 10 余种突变。我们在两个家系发现了两个新的点突变：一个错 义突变（T313M）和一个无义突变（R492Stop）。虽然 R492Stop 首先在一个台湾家系中被发 现[4]，但患者呈杂合状态，作为一个纯合性突变还是首次报道。
DJ-1 基因突变较少见，突变频率大约为 1％[9]。目前有 2 个涉及华人的研究，Lockhart 等[10]和 Tan 等[11]分别在台湾人及新加坡华人中均未发现 DJ-1 基因突变。本组 AREP 患 者中亦未发现 DJ-1 基因的致病突变，提示 DJ-1 基因突变在华人早发性 PD 人群中可能罕见。
2.对象和方法
本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20020533024）资助

2.1 对象 15 个 AREP 家系为中南大学湘雅医院神经内科及医学遗传学国家重点实验室
1997 年-2004 年所收集，来自 6 个省。诊断按国际公认的标准[5]。15 个家系共有患者 28 人， 男 18 人，女 10 人；发病年龄 13～40 岁，平均(26.12±8.04)岁。
显子 4 的 C938T 碱基改变使 HgaⅠ酶切位点消失。分别采用相应的限制性核酸内切酶对家系 成员及 100 名正常对照进行分析。酶切反应体系和反应条件参照 BioLab 公司的产品说明。 酶切产物经 6％PAGE 检测基因型。
3. 结果
3.1 基因突变分析： 3 个家系有 parkin 基因杂合突变。家系 3 外显子 2 发现 parkin 基

常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征致 病基因的突变分析
郭纪锋 唐北沙 张玉虎 李静
中南大学湘雅医院神经内科 湖南 长沙，410001
Email:bstang7398@
【摘要】目的 研究常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（autosomal recessive early-onset parkinsonism, AREP）parkin（PARK2）、PINK1（PARK6）及 DJ-1（PARK7）基 因的突变。方法 应用聚合酶链反应、DNA 直接测序和限制性核酸内切酶酶切等技术对 15 个 AREP 家系进行 parkin、PINK1 及 DJ-1 基因的突变分析。结果 在 3 个家系中发现 parkin 基因 3 个杂合突变，分别为 202-203delAG 和新发现的 1069-1074delGTGTCC 与 T1422C 突变。 在 2 个家系中发现 2 个新的 PINK1 基因突变，分别为 C938T 及 C1474T。其余家系均未见 parkin、PINK1 及 DJ-1 基因突变。3 个 PARK2 家系平均发病年龄（25.2±5.7）岁，临床上 肌张力障碍、姿势不稳、腱反射活跃、症状晨轻暮重常见，对多巴制剂反应好，左旋多巴诱 导的运动障碍常见；2 个 PARK6 家系平均发病年龄（25.8±10.0）岁，临床特征与 PARK2 相 似，但未见肌张力障碍、姿势不稳及左旋多巴诱导的运动障碍。结论 Parkin、PINK1 基因 突变是 AREP 的常见病因；DJ-1 在我国 AREP 中可能罕见；PARK2 和 PARK6 具有相似临床表现， 但均具有临床异质性。
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本组患者中未发现 DJ-1 和 TH 基因突变。

上图 正常对照； 下图 患者 A: 家系 3 先证者外显子 2 的 202-203delAG 改变 B: 家系 15 先证者外显子 9 的 1069-1074delGTGTCC 改变 C: 家系 1 先证者外显子 1 的 T1422C 改变
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现左旋多巴诱导的运动障碍，而 PARK6 未见。由于我们的样本较小，这些差别对于鉴别诊断 是否有帮助尚需要进一步探讨。
TH 基因是常染色体隐性遗传性 DRD 的致病基因，因 DRD 与 AREP 临床症状相似，故我们 对此组患者进行了 TH 基因的突变检测，结果未发现有该基因的突变。这进一步证明了 DRD 与 AREP 是两个相互独立的疾病。
因 202-203 位 AG 缺失(图 1,A)，产生一个只有 37 个氨基酸的截断蛋白；家系 15 外显子 9 发现 parkin 基因第 1069-1074 位 GTGTCC 缺失（1069-1074delGTGTCC）(图 1,B;图 2,A) ， 导致 parkin 蛋白第 323、324 位的半胱氨酸和脯氨酸缺失；家系 1 中外显子 12 上 1422 位碱 基 T→C 的改变（T1422C）(图 1,C;图 2,B)，导致 parkin 蛋白第 441 位的半胱氨酸转变为精 氨酸。其中 1069-1074delGTGTCC 和 T1422C 为新发现的突变。
家系 19
Ⅱ－1 Ⅱ-2 Ⅱ-5 Ⅱ－1
男
女
女
男
51
42
34
20
37
29
24
13
14
13
10
7
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