三种消化酶测定

蛋白酶活力的测定

[目的与原理]

掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。

动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。

[试剂与器材]

试剂：

1、福林试剂：在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2 H2O）100g，钼酸钠

(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。

2、0.55M碳酸钠溶液

3、10％三氯乙酸

4、0.02M pH7.5磷酸缓冲液：

0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。

将0.02M 磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M 磷酸二氢钠溶液16ml混合，即为0.02M pH7.5磷酸缓冲液。

5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5N NaOH 1ml湿润。再加少量0.02MpH7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至100ml，冰箱中可保存一周。

材料：

鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。

[实验步骤]

1、酶粗提液的制备

取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。

2、酶活力测定

（1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100ml，分别配制溶液0—100μg/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素

2ml，于370C 水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3ml，离心除去沉淀。取清液1ml，加入0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于370C水浴显色15分钟，在680nm波长下比色，测光密度（O D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。

（2）样品测定

样品测定设对照管和测定管。

37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。

3、计算

在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位

蛋白酶的活力单位＝A/15×F

A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数

F 为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min）

[方法评估]

福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。

[应用意义]

水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别是和动物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌握动物的营养需求。

[注意事项]

1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。

2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。

3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。

淀粉酶活力的测定

[目的与原理]

掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。

淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。

[试剂与器材]

试剂：

1、0.04%可溶性淀粉

精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml 刻度。此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。

2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。

3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。

材料：

新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。

器材：

分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml 比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。

[实验步骤]

1、酶提取液的制备（见实验蛋白酶活力的测定）

2、淀粉酶活力的测定

取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。