半数致死量的测定-Reed-Muench法[参考内容]

Reed-Muench法

物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：

1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性。

毒素和抗毒素亦可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。

用组织细胞进行中和试验，有常量法和微量法两种，因微量法简便，结果易于判定，适于作大批量试验，所以近来得到了广泛的应用。

(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)

1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD

50

)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测

定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD

50)或鸡胚半数感染量 (EID

50

)。用细胞培养测

定时，用组织细胞半数感染量(TCID

50

)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量

(IMD

50)或半数保护量(PD

50

)。

(1) LD

50

的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3……10-9，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。

LD

50

的计算：按Reed和Muench氏法计算。

高于50%的死亡分数-50% 83%-50% 距离比例= ──────────────────── = ─────=0.5 高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%－17%

LD

50

的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。代入上式：

LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5

则LD

50

=10-6.5，0.03ml，即该病毒作10-6.5稀释，接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。

注意：稀释血清法中和试验，计算TCID

50或LD

50

，MID

50

时，计算公式应改为：

TCID

50

的对数=高于50%血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数。

如按Karber氏法计算，其公式为：

IgLD

50（或TCID

50

）=L+d(S－0.5)

L为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数，S为死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3

=－4+(－1)×(3－0.5)

IgLD

50

=－6.5

则LD

=10-6.5，0.03ml

50

注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和

的测定（以新城疫病毒为例）将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成

2)EID

50

10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml，每个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38℃培养，每天照蛋，24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算 EID

。

50

的测定（以致细胞病变病毒为例）取新鲜病毒悬液，以10倍递次

(3) TCID

50

稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4只细胞管，接种病毒后的细胞管放在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置37℃吸附1h，加入维持液，置37℃

。

培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID

50

2.中和试验

(1) 病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如病毒的毒价为10-6，则试验组选用10-2－10-8对照组选用10-4－10-8其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。

(2)血清处理用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温度和时间也是不同的。

(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。

(4）感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或被检）血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组；充分摇匀后放37℃感作12h。