LDH Assay 测定药物细胞毒性

LDH Assay 测定药物的细胞毒性

（Promega The CytoTox-ONE分析法）

A．试剂的准备：

1、从-20冰箱中取出底物混合物及分析缓冲液置于4度箱溶解。

2、待混合物及分析缓冲液溶解后置于37度水浴箱中平衡5分钟。

以下过程，需避光操作

3、向平衡后的底物混合物中加入11毫升分析缓冲液。轻柔混合至底物完全溶化。

4、完全混合的溶液即为Reagent试剂，用1.5ml EP管分装，EP管事先已锡纸包裹。每支EP管内分装约24孔用量，650ul

Reagent应避光保存，在-20度可保存4~6周

B. 实验设计（48孔板）：

1、每株细胞铺设24孔，三复孔设计，共8组。2组无用药组，6组用药组

2、无用药a组在LDH实验中作最大LDH释放对照组，b组作FREE对照组。

3、无用药组b在MTT实验中作FREE对照组

C. 细胞毒分析流程：

1、取出过夜培养处于对数生长期，90%满瓶的细胞，消化。

2、向消化后的细胞瓶内加入6 ml完全培养液，充分吹洗，混匀。

3、取细胞培养平皿，加入5ml完全培养液，并加入第2步中充分混匀后的细胞2~3ml。混匀。

4、设置48孔板，并铺细胞

5、每孔加入至终体积250微升

6、37度培养箱中孵育过夜（按步骤3-5铺细胞，过夜细胞可达90%密度左右，不超过95%密度）

7、给药方法：a、从-20 冰箱中取出TRAIL蛋白，于4度冰箱内溶解后，置于冰上。

b、按最大给药孔药物浓度计算全部实验孔所需药量体积，并用完全培养液稀释药物。

c、取出48孔板，更换2%FBS的完全培养液，其中2组对照孔中加入200ul，其余给药孔按计算好的给药体系分别加入不同体积的2%FBS的培养液。

d、按计算好的各用药组所需药量体系给药，总体系200ul。轻柔混匀。

例子：95C，用药浓度50ng/ml 150ng/ml 300ng/ml 450ng/ml 600ng/ml 750ng/ml

药物母液浓度100ug/ml，按750ng/ml浓度，全部给药孔总需要量：1.5405.ml。预算损耗，总计配置1.6ml，750ng/ml的药物工作液。取母液12ul，用含2%FBS培养液稀释至1.6ml。给药：c步中低浓度至高浓度孔2%FBS培养液体积为186.6ul,170ul,140ul,110ul,80ul,0ul 低浓度至高浓度分别加入工作液13.4ul;30ul;60ul;90ul;120ul;200ul.。混匀

8、用药30小时后，取出培养板。（肉眼观察肿瘤细胞死亡是否与预计相同，如果跟假设有出入，则不进行LDH测定。因可能是实验误差甚至错误造成）

9、制备最大LDH释放对照组，无用药组a内加入4微升裂解液。37度孵育5至10分钟。

10、设置96孔板，从48孔板内各孔取25ul上清液至96孔板对应孔内。

以下操作避光

11、于96孔板内加入与上清液等体积的Reagent并混合摇匀30秒。

18、37度孵育5分钟

8、加入12.5微升终止液。

9、震荡10秒，并用560nm或590nm波长检测

注意：若平板未能避光保存，则应在1小时内测定数据以避免增加的背景光。

D. 结果计算：

1、获得减去BLANK孔的数值。

2、Percent cytotoxicity = 100 x (Experimental – Culture Medium Background-free)/(Maximum LDH Release – Culture Medium Background-free)