第三单元 免疫凝集类实验

孕妇尿液 不凝集 阳性对照
正常人尿(或NS) 凝集 阴性对照
如肉眼观察结果不清楚，可用显微镜在低倍镜下观察
注意事项
待测尿液宜采用晨尿，不能及时检测检测的标本应保 存于2~8℃，不能使用严重蛋白尿、血尿、菌尿标本； 试剂应4℃保存，切勿冻存。使用前使试剂接近室温并 摇匀； 应同时设臵阳性、阴性对照，以排除非特异性凝集； 所加液滴应大小一致； 结果应在强光下观察，观察时应臵黑色背景下或稍倾 斜反应板。
见习内容与要点
结果分析
将载玻片臵黑色背景上观察。 在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则 为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性 结果。 肉眼观察不够清晰者，可在低倍镜下观察。
实验讨论
肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用 已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体 及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝 集现象。 临床上开展的外斐反应是利用与立克次体有共同耐热性多糖抗 原的变形杆菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次体作为已知抗原 ，与患者血清进行凝集试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等 立克次体疾病。 现有OX19 、OX2 、OXk 三种诊断菌液和待测血清，请写出利用 试管凝集法进行的外斐试验的操作步骤。
连续轻轻摇动反应板，2～3分钟后观察结果。
结果判断
若胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性反应 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴 性反应
注意事项
试剂应4℃保存，严禁冻结，用时摇匀；
所有试验器皿和反应板均应洗净、干燥；
若阴性对照出现凝集，则表示致敏乳胶试剂有 质量问题，不能使用。
以胶乳凝集试验检测类风湿因子（rheumatoid
factor,RF）为例验证间接凝集实验的原理和特点
实验原理
类风湿因子（RF）是一种抗变性IgG的自身抗体， 具有与人或动物变性IgG结合的特点。将处理过的人IgG
与聚苯乙烯胶乳颗粒结合成致敏颗粒，当待测血清中含
有RF时，则与致敏颗粒上变性的IgG发生反应，出现凝 集现象。
试管凝集法操作程序
试管号 1 2 3 4 5 6 7
生理盐水（ml) 0.5 待测血清（ml) 0.5 伤寒O菌液(ml) 0.5 血清稀释度 1:80
0.5 0.5 0.5 1:160
0.5 0.5 0.5 1:320
0.5 0.5 0.5 1:640
0.5 0.5 0.5 1:1280
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1:2560
注意事项
凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应 一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗 体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时， 须加大抗体稀释倍数重新试验。 直接凝集试验也可以用玻片法 以鉴定伤寒沙门菌为例：取洁净载玻片2张，在玻片的左上角分别标 明“1”、“2”； 加入已知抗体（伤寒沙门菌诊断血清）和待测菌 液（伤寒沙门菌或其他细菌）。
“+++”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底 “++”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底 “+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集 “-”：不凝集，液体浊度与对照管相同
血清抗体效价：试验管出现“++”以上的凝集现象即可判断为阳
性；以出现“++”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。
待测尿液 (含HCG)
抗HCG
＋
特异 结合
NS
抗 原 抗 体 复 合 物
致敏胶乳
无凝集颗 粒为阳性
待测尿液 (无HCG)
抗HCG
＋
无结合
NS
致敏胶乳 有凝集颗 粒为阴性
实验器材和材料
器械 黑色方格反应板、毛细滴管 试剂与标本 胶乳抗原（HCG致敏的胶乳颗粒）、抗HCG抗 体（商品化） 孕妇尿液、正常人尿液、待测尿液。 生理盐水
实验结果分析和讨论
妊娠免疫诊断试验是临床常用的经典胶乳凝集抑制试验， 操作简便、快速、特异性强，停经35～40天以上的孕妇可 测得阳性结果。需注意的是，绒毛膜上皮癌、葡萄胎及睾 丸畸胎瘤病人尿中HCG含量远较正常妊娠尿液为高，将尿 液作1∶200稀释后仍可呈阳性反应。 待测尿液以晨尿为好。测试时应注意标本及各诊断试剂加 入的顺序，并设立阳性和阴性对照。试分析若随意变更加 样顺序，如先加标本、再加胶乳抗原，最后加抗HCG或先 加胶乳抗原、再加抗HCG，最后加标本，结果如何？ 凝集抑制试验可用于确证呈阳性反应的间接凝集实验是否 是非特异凝集反应，试讨论如何进行该项实验？
实验方案讨论
凝集反应可分为哪两个阶段？其中可见反应阶段主要受 哪些因素影响？可否根据影响因素，通过设臵低离子强 度介质以降低红细胞的Zeta电位和加入高价阳离子盐类 以中和红细胞表面负电荷等来促使红细胞凝集？此时又 如何判断是特异性凝集还是非特异性凝集？ 红细胞表面的不完全抗体是IgG，即免疫球蛋白，此时 若在反应体系中加入抗人球蛋白，会出现何结果？抗人 球蛋白如何制备？ 如何检测血清中未与红细胞结合和与红细胞结合的不完 全抗体？
实验结果分析和讨论
胶乳凝集试验方法简便、快速，但易发生非 特异性凝集反应，试分析如何判定实验的非 特异性凝集反应。 判断凝集或凝集程度除目测外，是否还有其
他方法？
验证实验三ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
间接凝集抑制实验
概念
间接凝集抑制试验（indirect agglutination inhibition test） 是以抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测 标本中是否含有与致敏抗原相同的抗原的试验。检测时先 将抗体试剂与待测标本混合，再加入抗原致敏的载体。若 标本中没有与抗体试剂相对应的抗原，则抗体试剂与随后 加入的致敏载体上的抗原结合而出现凝集；若标本中存在 与抗体试剂相对应的抗原，抗体先与之结合，随后加入的 致敏载体上的抗原则无抗体结合，凝集反应被抑制。 本实验以检测尿绒毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫诊 断试验为例进行胶乳凝集抑制现象的观察和验证。
1. 取试管7支，依次编号并做好标记。 2. 每支试管中加生理盐水0.5ml。 3. 倍比稀释血清： 取1∶20稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后 吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后 吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。 4. 加诊断菌液： 每管加伤寒沙门菌H或O诊断菌液0.5ml，此时各管 血清最终稀释度依次为1∶80、1∶160、1∶320、 1∶640、1∶1280、1∶2560 5. 摇匀后臵37℃水浴2～4h，取出观察结果或放室温过夜， 次日观察结果。
第三单元
免疫凝集类实验
验证实验一
直接凝集实验
颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解 质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。 常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。
本 实 验 以 试 管 法 凝 集 试 验 —— 肥 大 试 验 （Widal test）验证凝集反应及其特点。
Widal test原理
实验设计的策略
不完全抗体只含有一个抗原结合位点， 能与相应抗原结 合，但不产生可见反应，因此也称单价抗体 。
抗红细胞不完全抗体与红细胞结合后，因抗体分子小， 不能有效地连接红细胞，仅使红细胞处于致敏状态，而 不出现可见的凝集反应。 在实验设计时，基本的思路是采用红细胞作为凝集试验 的抗原，创造条件设法使相邻的红细胞靠近、聚拢、凝 集从而达到对红细胞不完全抗体的检测目的。
实验方法
在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别加待测尿 液、孕妇尿液、正常人尿液（或生理盐水）1滴，然后每 格加抗HCG抗体1滴，轻轻摇动1～2min。 于上述3格中各滴加胶乳抗原1滴，轻轻摇动2～3min后观 察结果。
结果判断
样本 现象 结果判定
待测尿液 凝集 或不凝集 非妊娠尿 或妊娠尿
免疫凝集分析系统——全自动血型分析系统
（临床见习）
基本原理
全自动血型分析系统采用柱凝集血型诊断系统试剂卡技术和数 字图像处理技术自动实现人血样本的体外免疫血液检测。 ABO/Rh 血型诊断试剂卡是基于独特的柱凝集技术原理而设计 的。该卡是在一种特制的塑料卡上设计有6个微柱，每个微柱中 均装有一定数量具有分子筛作用的玻璃珠，并分别预臵了抗A 、抗B、抗D特异性抗体的试剂。当受检者红细胞进入测试柱与 相应抗体反应并经低速和高速双相离心后，发生凝集的红细胞 被阻滞在玻璃珠的上层（阳性），而未凝集的游离红细胞则会 在离心力的作用下通过玻璃珠介质之间的间隙沉积于柱的底部 （阴性）。由此可将凝集红细胞与未凝集红细胞分开，达到鉴 定ABO/Rh血型的目的。
不完全抗体检测的实验设计
（设计性实验）
实验目的
采用红细胞作为凝集试验的抗原，创造条 件设法使相邻的红细胞靠近、聚拢、凝集从而达 到对红细胞不完全抗体的检测目的。
问题背景资料
抗体与相应抗原结合后，在适宜的介质参与下可 出现可见的抗原抗体反应。但有些分子较小的7S的IgG类 抗体，体积小，长度短，在适宜介质中与相应抗原结合 后不出现可见反应，这种抗体称为不完全抗体，如抗红 细胞Rh抗原的抗体等，这种抗红细胞不完全抗体的存在 是引起输血不良反应的主要原因之一，有必要设计检测 不完全抗体，特别是针对红细胞抗原不完全抗体的的检 测方法。
胶乳颗粒
人IgG
致敏
致 敏 胶 乳
NS
待测RF 凝 集 颗 粒
实验器材
器械 黑色方格反应板、毛细滴管、试管、试管架、吸 耳球、恒温水浴箱等 试剂 人IgG致敏胶乳试剂（市售类风湿因子检测试剂） 类风湿因子阳性血清和阴性血清：临床标本筛选获得 待测血清
实验方法
待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水作1∶20 稀释。 在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别滴加稀释 待测血清、阳性血清、阴性血清各1滴，然后每格加入人 IgG致敏胶乳试剂1滴。
1 生理盐水 + 伤寒杆菌 1:40 伤寒杆菌诊断学清 + 伤寒杆菌 2 生理盐水 + 大肠杆菌 1:40 伤寒杆菌诊断学清 + 大肠杆菌
玻片凝集试验鉴定伤寒沙门菌
玻片凝集试验 (slide agglutination test)
在玻片上
颗粒性抗原与相应 抗体直接结合
+ +


？
出现肉眼可见的凝 集现象
0.5
菌液 1
0.5 0.5 0.5 0.5
弃掉0.5
2
3
4
5
6
7
结 果
试 管 凝 集 试 验 原 理
结果判断
实验结果
将试管臵于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清 液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用++++、+++、++、+、-等 符号记录凝集效价。
对照管：应无凝集现象 试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底
思考题
为什么临床上不直接利用立克次体作为已 知抗原进行血清学诊断呢？
验证实验二
间接凝集实验
间接凝集实验（indirect Agglutination Test)
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关、大小 均匀的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后再与 相应抗体（或抗原）结合，在适当电解质存在的条件下， 载体颗粒被动地发生凝集，出现肉眼可见的凝集现象。
将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量 加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清 稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其 相对含量。
实验器材和材料
器械
试管、吸管、恒温水浴箱等
试剂
抗体 待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原 伤寒沙门 菌诊断菌液（7×108/ml)、生理盐水
实验方法（Widal test）
实验原理
孕妇尿液中含有HCG，正常人尿中无HCG。当向孕 妇尿中加入一定量抗HCG抗体时，尿HCG即与抗HCG发 生抗原抗体反应，此时，再加入胶乳抗原（吸附有HCG 的聚苯乙烯胶乳颗粒），因抗体被消耗，故不能发生凝 集，即凝集被抑制，为凝集抑制试验阳性；反之，若待 检尿中无HCG（非妊娠尿），则加入的抗HCG抗体未被 结合和消耗，可与随后加入的乳胶抗原发生反应，出现 肉眼可见的细小颗粒，即凝集未被抑制，为凝集抑制试 验阴性。