吖啶橙荧光染色法

【实验原理】

吖啶橙（acridine orange，AO）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm），核仁和胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。

【实验用品】

1、器材

荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。

2、试剂

（1）l PBS液

A液：NaH

2PO

4·H

2O 2.76g，加蒸馏水至100ml；

B液：Na

2HPO

4·7H

2O 5.36g，加蒸馏水至100ml；

取A液＋B液＋NaCl ，用蒸馏水稀释至100ml。

（2）1%吖啶橙原液

取吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用PBS溶液稀释10倍）。

3、材料

口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。

（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。

（2）95%乙醇溶液固定5min。

（3）滴加%吖啶橙染液5min。

（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。

【结果与观察】

荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光

体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色

【注意事项】

（1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。

（2）每种荧光染料，均有自己的最适pH，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。