谷胱甘肽的简便测定法

谷胱甘肽的简便测定法

药物分析杂志 2000年第1期第20卷研究简报

作者：赵旭东魏东芝万群俞俊棠单位：赵旭东魏东芝万群俞俊棠（华东理工大学生物反应器工

程国家重点实验室上海200237）

关键词：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB 摘要：目的：建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。方法：样品1式2份，pH 8.0条件下分别和甲醛反应2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 ℃反应5 min后分别测定在波长412 nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。结果：谷胱甘肽浓度在0.19～0.95 g·L-1之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大误差不超过6%。结论：方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。

A Simple Method for Rapid Determination of Reduced

Glutathione

Zhao Xudong Wei Dongzhi Wan Qun Yu Juntang （State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry,

East China University of Science and Technology, Shanghai 200237）

Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances.Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 ℃. The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(ΔA=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve.Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 g·L-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%.Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances.

Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB▲

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸组成的天然三肽，用途广泛。利用基因工程微生物生物合成方法是生产谷胱甘肽的主要方式。作为前体之一，半胱氨酸的浓度较高，对谷胱甘肽的测定有干扰。已有几种方法用于半胱氨酸存在时谷胱甘肽的测定：酶分析方法［1，2］可测高达1 000倍半胱氨酸存在时谷胱甘肽的含量，结果较准确，但需价格昂贵的辅酶Ⅱ和谷胱甘肽还原酶，并且后者活力变

化严重影响测量结果；色谱法［3，4］冗长费时；Jocelyn［5］采用将样品在硫酸中煮沸1 h的方法，不太安全；Wronski［6，7］方法效果较好，但需用对羟基汞苯甲酸和萤光黄；荧光法［8］容易受干扰，误差较大；乙二醛酶法［9］需要复杂的技术和设备。针对上述方法的不足，本文在研究甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应特点的基础上结合巯

基的测定方法［10，11］提出一种简单，快速的新方法，应用于生物合成反应溶液中谷胱甘肽含量的分析取得满意结果。

1 仪器和试剂

752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，恒温水浴槽(上海医疗器械五厂)。

GSH，Gys，为生化试剂；3%甲醛溶液由分析纯试剂加水配制，用NaOH调节pH为8.0；0.25 mol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液由生化试剂配制；0.01 mol·L-1DTNB［5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)］溶液由生化试剂加0.05 mol·L-1 pH 7.0的磷酸缓冲液配制，存于棕色瓶中，放于低温暗处备用；DTNB分析溶液由1体积0.01 mol·L-1DTNB 溶液加100体积0.25 mol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成，现用现配；其它试剂为分析纯；所用水为去离子水。

2 分析方法

待分析样品(Cys含量不大于20 mmol·L-1，GSH浓度小于0.9 g·L-1)1 mL 2份，每份加入0.25 mol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液3 mL，摇匀，再加入3%甲醛1 mL，摇匀，室温下分别准确静置2 min 和60 min后，立刻取1 mL加入预先恒温于25 ℃水浴中的DTNB分

析溶液5 mL，摇匀，准确静置5 min后，立刻在波长412 nm处测定吸光度A，算出2者的A值之差ΔA，代入回归方程计算相应谷胱甘肽浓度，最大误差不超过6%。

3 结果

3.1 显色溶液的稳定性准确称取GSH溶于pH 6.5去离子水配成0.48 g·L-1的标准溶液，取1 mL按上述方法分析，已知室温为26 ℃，5 mL DTNB溶液预先恒温于25 ℃水浴中，分别加入已与甲醛反应2 min 和60 min的样品溶液1 mL后迅速摇匀，以此刻作为反应开始，于不同时间测定吸光度，见表1。可知反应开始1.5 min到10 min之间显色溶液保持稳定，考虑到因季节不同，与甲醛反应后的样品溶液温度变化，1 mL该溶液加入5 mL预先恒温于25 ℃水浴中的DTNB溶液后需1～3 min才能恢复到25 ℃，选择5 min为反应时间。

表1 显色溶液在不同反应时间的吸光度