植物制片技术
植物制片技术教学大纲
3.染色的方法
第三节封片（掌握）
1.封片法
本章重点、难点：
染色
本章教学要求：
掌握染色与封片
第六章显微摄影与图像分析
第一节切片材料的显微观察和注意事项（掌握）
第二节切片材料的测量方法（掌握）
第三节显微摄影时的注意事项（了解）
第一节图象的输出（掌握）
本章重点、难点：
材料的显微观察、测量
第三节透明（掌握）
1.透明的目的
2.透明剂及其透明法
第四节药品的回收与再用（了解）
1.包埋剂与包埋用具（了解）
2.石蜡渗透
第六节石蜡包埋（掌握）
1.包埋的操作过程
2.包埋中出现的问题及其解决办法
本章重点、难点：
石蜡包埋
本章教学要求：
掌握冲洗、脱水、透明与浸蜡、石蜡包埋方法
第四章切片、贴片与烘片
第一节切片（掌握）
三、学时分配
教学课时分配
章节
绪论
第一章
第二章
第三章
第四章
第五章
第六章章节内容
植物制片的基本原理与过程
手工制片、整体封片
材料的采集与分割取材、固定及试剂的配制
冲洗、脱水、透明与浸蜡
切片、贴片与烘片
染色与封片
显微摄影与图像分析
合计讲课111111
6实验0实践合计
四、教学内容及教学要求
绪论植物制片的基本原理植物制片的基本过程
第一章手工制片、整体封片
第一节手工制片的基本原理和过程（掌握）
第二节整体封片的基本原理和过程（掌握）
本章重点、难点：
手工制片、整体封片过程
本章教学要求：
掌握手工制片、整体封片方法
植物显微
植物显微制片技术——石蜡切片一、原理：多数生物材料在自然状态下不适合显微观察，也无法看到其内部结构，因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构。
另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辨明。
但在经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等程序后，就可把材料切成极薄而且连续的切片，可以较清楚地显现细胞、组织的细微结构。
若用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成分含量的变化，在显微镜下清楚看到其中不同区域的组分状态。
几个关键步骤的原理如下:1、固定，是指用物理或化学的方法，迅速杀死植物的细胞、组织，使其形态结构尽可能保持在接近其生活时的状态。
2、脱水，是用脱水剂逐步取代样品中水分的过程，因水与透明剂、包埋剂不相溶，所以不能直接进入透明和包埋，必须经过脱水，逐步、彻底除去样品中的水分才能进入透明、包埋。
3、透明，是材料经过乙醇脱水后，组织内部已经没有水分，但脱水剂乙醇不能与石蜡相溶，石蜡不能进入细胞或组织，还要经过一种既能与脱水剂混合又能溶解包埋剂的溶剂（本次实验用二甲苯）来处理，便于包埋剂浸入植物组织或封藏。
4、浸蜡，是将包埋剂石蜡逐步透入植物细胞核组织取代透明剂的过程，石蜡在液体状态下浸入到细胞，在熔点以下温度条件下凝固成固体，起支撑作用，使切片后的细胞和组织固定在原位。
二、材料和用具：1、生物材料：桉树茎2、药品：FAA固定液、各级浓度的酒精、1%番红、固绿、二甲苯、石蜡、加拿大树胶等3、实验用具：带橡皮塞的小瓶、染色缸、小坩埚、小木块、纸盒、载玻片、刀片、镊子等4、仪器：光学显微镜、烘箱、恒温箱、电炉、切片机、展片台等三、制作方法（流程）：取样、材料的选择与分割→固定（FAA固定液）→冲洗（70%酒精）、染色（番红）→脱水（各级乙醇，低浓度→高浓度）→透明（二甲苯，低浓度→高浓度）→浸蜡（低浓度→高浓度）→包埋→修块与固着→切片→展片、粘片、镜检、烘片→脱蜡→复水（各级乙醇，高浓度→低浓度）→复染（固绿）→脱水（各级乙醇，高浓度→低浓度）→透明→封片→观察、照相四、结果：见附图五、讨论：在上述主要环节中，每一步都必须仔细操作，任何一步出现问题，都会影响制片质量。
实验一 植物制片技术
实验一植物制片技术临时水封玻片一、实验材料生物材料。
洋葱鳞茎、番茄。
实验用具。
显微镜、镊子、解剖针、小块软布、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸。
实验药品。
蒸馏水、稀释碘酒。
二、制作临时装片的程序和步骤（1）擦载玻片。
用左手的拇指和食指捏信载玻片的边缘，右手用软布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好后放在干净处备用。
（2）擦盖玻片。
先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再将右手拇指和食指用软布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着软布慢慢地进行擦试。
（3）用吸管在载玻片中央滴一滴清水（或直接滴加稀释碘液用以染色）。
（4）a. 洋葱表皮细胞观察取一块洋葱磷叶，在其内面（凹面，无色）用刀片浅划出长2mm的正方形，用镊子从正方形的一角撕下一小块洋葱内表皮，把洋葱内表皮放在载玻片的水滴中展平。
b. 果肉离散细胞观察用解剖针挑取少许已红熟的番茄果肉（以临近果皮的为好），把它们放在载玻片上的水滴中，用解剖针将果肉细胞拨匀，分散得越开越好。
（5）右手持镊子，轻轻夹住盖玻片一角，使盖玻片的边缘与液滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上，避免气泡的产生。
（6）盖玻片下水太多，可用吸水纸从一侧吸去，水少也可从一侧加入。
2、染色（1）把一滴染液滴在盖玻片的一侧；（2）用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引使染液浸润整个标本；（3）使盖玻片下的标本均匀着色。
徒手切片一、实验材料生物材料。
芹菜幼茎；水花生幼茎和叶片；2cm×1cm×0.5cm的土豆（或胡萝卜块）。
实验用具。
显微镜；双面刀片；载、盖玻片；镊子；培养皿。
实验药品。
蒸馏水；0.1%番红水溶液；1%甘油水溶液。
二、实验步骤1. 取材。
选择发育正常，有代表性的幼茎或叶片，用刀片从植株上割下，立即进行切片或保存在水中以防萎蔫。
2. 切片。
取茎长约1-2cm（如果是叶片等较为柔软的材料用胡萝卜或土豆等作为支持物，叶片大小为1×1cm），以左手的拇指、食指和中指夹住材料（要求材料突出在指尖上面约2-3mm），用右手握住刀片，刀口向内，以均匀的动作做横切面切片（切片时刀口和材料表面都要经常湿水，使之滑润），多切，掌握技巧，切片放入培养皿清水中充分展开。
植物细胞学分析之组织切片技术
植物细胞学分析之组织切片技术一、试剂（1）卡诺氏固定液：无水乙醇与冰醋酸按体积比为3:1混合配制。
（2）1mol／L盐酸溶液：取浓盐酸（比重1.19）82.5ml，加入蒸馏水917.5ml。
（3）醋酸洋红染液：4-5g洋红，冰醋酸45ml，蒸馏水55ml，先将冰醋酸加入蒸馏水中煮沸，然后将火移去，立刻加入洋红，用玻璃棒搅匀溶化，冷却后过滤即成。
（4）70%酒精；95%酒精。
二、细胞分析方法1．有丝分裂全过程的染色体制片方法步骤：取材-预处理-固定-根尖解离1mol/L HCL-醋酸洋红染色-压片（1）发根挑选每份黑麦种子材料25粒，经流水冲洗，放于培养皿内温水浸泡24h。
置于25℃恒温箱中发根。
待根长到1～2cm时，于适宜时间用蒸馏水洗净，将水吸干，剪取根尖0.5～1cm进行预处理。
为获得尽可能多的分裂相，根尖以上午9～10时剪取为宜。
（2）预处理为了有利于有丝分裂中，染色体的观察和计数，通常要对材料进行不同的预处理。
预处理主要通过抑制和破坏纺锤丝的形成，来获得更多的中期分裂相，同时还可以改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。
将根尖浸于蒸馏水内，1-4℃低温处理24h。
（3）固定材料经预处理后，用流水冲洗2次，然后投入卡诺液（3份甲醇∶1份冰乙酸）中固定26h，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用（4℃）。
固定的目的是：①迅速防止细胞死亡后的变化，如自溶、腐败等，尽量保持生长状态结构。
②使细胞中的蛋白质、脂肪等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。
③使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。
④使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。
⑤防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。
（4）解离常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗后，吸水纸吸干，放入盛有1 mol/L的HCl的1.5ml离心管中，60℃水浴，恒温条件下解离10min。
植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁结构将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，这一操作称为解离。
实验一 植物学实验的基本研究方法
实验一植物学实验的基本研究方法一、目的要求通过本实验教学，要求学生掌握植物学研究的基本方法、养成良好的实验习惯、打下良好的实验基础；了解光学显微镜的基本结构和工作原理，并掌握其使用方法；了解常用的植物制片技术；掌握生物绘图的基本方法。
二、材料用品洋葱表皮细胞装片、洋葱鳞叶。
生物显微镜。
培养皿、载玻片、盖玻片、滴瓶、滴管、搪瓷方盘、吸水纸、擦镜纸、镊子、解剖针、刀片、蒸馏水等。
三、实验内容和方法（一）显微镜的基本结构显微镜的类型很多，有的较简单，但其基本部分大至相同。
一般光学显微镜可分为光学系统部分和机械装置部分。
光学部分的使用在于保证成像，而机械部分则是用于装置光学部分的。
1、显微镜的机械装置镜座：这是显微镜的基础部分，呈马蹄形、方形、圆形等，本实验室所用的显微镜的镜座为方形，它是用来支持整个镜体的。
镜柄（镜臂、执手）：镜柄靠倾斜关节（或螺丝，本室所用显微镜无倾斜关节）与镜座上的一短柱（镜柱）相连，弯曲呈弓臂形，但也有靠镜筒变换位置（即无倾斜关节时）的。
取用显微镜时，手就执着这部分。
镜筒：有的将它归入光学部分，镜筒为镜臂上方的圆筒部分，在它顶端的孔中放入接目镜，下端装有转换器与接物镜。
国产显微镜的镜筒通常是160毫米。
调节器（配焦器、调节螺旋）：在镜臂上端，镜筒的两侧，盘状而可以旋转的部分，叫做调节器或调节螺旋，将调节器前后旋转，可使镜筒升降，用以调焦距，使物像清晰。
调节器分大、小两种，大的叫粗调节螺旋，每旋转一周可使镜筒上升或下降10毫米，由于它的移动范围大，所以，可将物像迅速观察到，但调节焦距粗放，物像欠清晰；小的叫细调节螺旋，每旋转一周，可使镜筒上升或下降0.1毫米，用细调节器可看到完全清晰的物像。
载物台（镜台）：载物台位于镜座的上方，为方形或圆形的平台，为安置镜检的玻片标本之用，台中央有一圆孔，以通光线，故称为通光孔。
在通光孔的后方，有一以对压片夹，用来固定玻片标本，好的显微镜，载物台上配有载片移动架，可使玻片标本前后左右移动。
染色体数目众多的植物玻片制片技术
染色体数目众多的植物玻片制片技术摘要：探究体积较小且数目众多的植物染色体制片方法，摸索一套适合这类植物的制片方法，为这一类植物的染色体鉴定提供资料。
关键词：染色体；制片；技术中图分类号：q943-3 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-12-0031-1目前，针对部分染色体数目众多、体积太小或染色体过于细长，容易缠绕的植物，其玻片制作仍然存在着较大的难度，国外在这方面也早有研究[1]。
本文以杨柳科杨属的滇杨（populus yunnanensis dode）[2]作为例子简介这一类植物的制片方法。
1 材料与方法1.1 材料试验材料为西南林业大学校园内生长健壮，无病虫害的成年大树的两年生滇杨枝条，剪取后置于水桶中于室温下水培。
1.2 方法参考李懋学[3，4]，李国珍[5]，康向阳[6，7]等在文中所提到的实验方法，结合改良后的部分操作步骤进行制片。
实验前将从室外采集的枝条下半部约10cm高的部位浸入水中培养，待其根长约1～1.5cm时，选取生长良好、粗壮的根，截取整个根部置于装满蒸馏水的培养皿中待用。
1.2.1 预处理分别用0.2%秋水仙素、对二氯苯饱和水溶液、0.002mol/l 8-羟基喹啉、8-羟基喹啉0.002mol/l+秋水仙素0.2%、8-羟基喹啉0.002mol/l+对二氯苯饱和以及低温4°24h作为预处理组合，分别对滇杨根尖处理1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h ，从而确定最佳预处理的药剂和时间的组合。
1.2.2 固定将经过预处理后的材料转入固定液中进行固定，固定液组合为（ⅰ：冰乙酸：无水乙醇为1：2；ⅱ：冰乙酸：无水乙醇为1：3）于冰水混合物、4℃以及常温中固定1.0、2.0、4.0、20.0、24.0h ，从而确定最佳的固定药剂和固定温度的组合。
1.2.3 解离将上一步骤中经过固定的材料，利用hcl和酒精混合的解离液进行解离（组合ⅰ：1mol/l盐酸：无水乙醇=1：1；组合ⅱ：浓盐酸：无水乙醇=1：1），于常温、40℃±1℃、60℃±1℃中进行解离，以期获得最佳的解离时间及温度的组合。
植物石蜡切片法显微制片技术
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置
对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶
片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意 刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄 蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时， 需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植 物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）； 对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率 较低。
（五）脱水
• 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分 解。而且透明剂与水是不相混合的，不利 于材料的透明和包埋等后期处理。因此需 用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让 石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关 键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能 与其他有机溶剂互相替代。
• 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止 吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水 剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。
• 浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。
• 每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。
（八）包埋
• 材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡 块，以备切片。
• 操作方法：根据切片材料大小，确定所 需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先 叠好纸盒。
（九）切片
• 即（二）固定
• 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固 定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止， 并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变 化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折 光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新 鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、 大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上 标签。
植物切片制作
植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分。
植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。
徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。
优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中，便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块，一般以长2~3cm，切片断面不超过3~5mm2为宜。
对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。
有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。
实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。
2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。
3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
4、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。
用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。
简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
细胞核染料（碱性染料）： 苏木精，亚甲蓝，中性红，碱性品红，洋 红，地衣红，结晶紫，番红，甲苯绿，碱 蓝。 细胞质染料（酸性染料）： 酸性品红，亮绿，苯胺蓝，固绿，刚果红， 橘红G，曙红，贾纳斯绿，孔雀绿，甲基橙。
植物制片的一般原理
3. 染色方法
⑴死细胞染色。 ⑵活细胞染色。 选无毒性染料。 观察细胞质流、精子或流动孢子等。
植物制片的一般原理
5. 封边剂
石蜡，油漆，指甲油。
植物制片的一般原理
四、染色 一般做成永久切片观察的材料， 都需要染色。
植物制片的一般原理
1. 染色原理
很复杂，难以解释。 ⑴物理学的解释 ①毛细作用或渗透作用而进入组织的内部——因 为组织材料有孔隙。 ②电子吸附作用——因而染色牢度有强有弱。 ⑵化学上的解释 组织或细胞中的各部分，或是酸性的（结合阳离 子，即碱性染料），或是碱性的（结合阴离子， 即酸性染料）。但没有新物质形成。
植物制片的一般原理
⑶醋酸（乙酸，CH3COOH） 单独使用，浓度为0.3－5%。 特点：渗透力大，固定十分迅速，但易使 细胞发生膨胀。 常与甲醛（易引起收缩）混合使用。
植物制片的一般原理
⑷锇酸（OsO4） 四氧化锇，灰黄色结晶，中性，昂贵——白金。 使用浓度为1－2%。 强氧化剂，配制水要超净，不宜与还原性固定剂 配合。 特点： ①最好的固定剂，对细微结构的固定良好，是脂 肪性物质唯一的固定剂。
植物制片的一般原理
④不改变原生质原来的体积（膨胀或缩 小）； ⑤增加细胞内含物折光程度，易于鉴别； ⑥可增加媒染作用和染色能力； ⑦又能有保存作用。 单一的化学药品难以具备以上所有条件； 而几种药品混合，可成近似理想的混合固 定剂。
植物制片的一般原理
植物学实验三切片法及根形态
** 封片：染色后，加水封片。（或制成永久标本）
** 观察：去多余液体后，显微镜下观察。
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7
滑走切片：
----利用滑走切片机切片；切片不连续、较厚；多用 于木本茎的切片。
一般步骤：
** 取材：选择用于切片的茎，将其切成小段。
** 软化：用软化剂将材料软化。
方法：A、沸水中煮2小时。
B、50%乙醇/甘油（1：1）浸1-2周。
----以塑料作为包埋剂，在超薄切片机上切片。
切片不连续，薄1 um。
一般步骤：P教材18-23
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9
植物根的形态结构
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10
根系：
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11
根尖分区：
成熟区（根毛区）
伸长区
分生区
根冠区
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小麦根尖分区的观察：
** 载玻片上滴一滴水； ** 取一段小麦根尖（1cm）于载玻片的水中； ** 盖上盖玻片压片后观察。 ** 加碘液后再观察。
5、初生木质部；6、髓
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双子叶植物次生根
1
2
1、表皮
2、皮层
3
3、中柱
4、内皮层
4
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单子叶植物根
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侧根的形成
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根瘤
菌菌 根 可编辑ppt
菌
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1、徒手切片法的学习 ----芹菜叶柄
（观看录像）
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20
2、根的徒手切片方法
1）取一段植物根（成熟区）1cm于载玻片上； 2）加一滴番红染色1分钟，加水清洗后备用； 3）取萝卜块按要求修整， 4）将根夹在萝卜块中按徒手切片法进行切片， 5）选择好的切片不进行染色处理直接装片观察。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法
植物制片的染色及显微化学鉴定方法Revised as of 23 November 2020植物制片的染色及显微化学鉴定方法一、目的与要求1、学习植物制片的一般染色方法。
2、学会并掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞内主要后含物性质的鉴定方法。
二、材料和用品1、自备材料：植物叶片、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等等，解剖器、剃刀或双面刀片。
2、其它材料和用品：显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、吸水纸、蒸馏水、染色缸；%番红、% 固绿或1%苯胺蓝等染液、中性树胶、二甲苯、酒精、碘—氯化锌、盐酸—间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘—碘化钾、10%氯化铁、盐酸等。
三、实验内容1、植物制片的染色方法2、常用显微化学鉴定法四、实验方法1、植物制片的染色方法用徒手切片法切得的薄片，如果仅仅是为了临时观察，制成临时装片即可，这种临时制片不能长久保存，只能作临时观察之用，又由于没经过染色，结构显示的也不够清晰。
为了求得更清晰地显示其细微结构及化学成分，并能够较长时间的保存，可以进一步染色及其它处理以至封片，从而可制成半永久或永久制片。
常用的染色方法是番红—苯胺蓝（或固绿）二重染色法，具体操作方法有二：方法一：（1）将植物切片材料放入30%酒精中，5分钟后移入水中。
（2）用%番红水溶液染色12—24小时。
（3）倒去番红液，用清水冲洗数次后，再放回50%酒精中浸泡5分钟。
（4）将材料从50%酒精中转入70%酒精中脱色，直至硬木质化的细胞壁呈现红色，其它部分呈粉红色或近于无色时为止。
（5） 1%苯胺蓝（用70%酒精配制）对染2—5分钟。
若用%固绿对染，则仅需半分钟左右即可。
注意：此步染色，要不时地在显微镜下检视，切忌染色过深，当木质化细胞壁呈红色，其它部分为淡蓝或淡绿色时，即可停止。
（6）用95%酒精冲去多余染液，再经无水酒精脱水5分钟。
（7）放入等量无水酒精与二甲苯溶液中及纯二甲苯中透明各3分钟。
（8）将切片材料移入载玻片上，在二甲苯未干时立即加一滴中性树胶封片，尔后将玻片平放，自然凉干或置于摄氏35度温箱中烘干。
植物组织(枝条、叶片、木材)切片处理和图像分析-YYM - 修改1
植物组织切片实验步骤一、野外采样枝条采样：选取冠层阳生枝条，一般长度约50cm，直径约1-2cm。
用高枝剪采集，做好采样记录和样品标记，装入黑色塑料袋内，带回实验室。
叶片采样：选取健康叶片进行采样。
根据试验需要，一般采集冠层阳生叶片。
做好采样记录和编号后，装入黑色塑料袋或自封袋，带回实验室。
二、植物叶片生理性状测定：叶片面积（Aleaf）测定：对于野外采回来的叶片,在叶面积仪(LI-3000A,LI-COR,Nebraska)上测定叶面积；叶片干重（Wleaf）：将干净,新鲜的叶片,放在70°C的烘箱中48小时，然后用电子天平测量叶片干重；比叶面积SLA（比叶重 LMA）：SLA=LA（叶面积）/DW（叶片干重）；叶片饱和重（Wleaf_saturated）：将叶片放在纯净水中，浸泡24h，从水中取出后，擦干叶片表面水分后立刻测定其饱和重；叶片相对含水量（SWCleaf）：=（叶片鲜重-叶片干重）/（叶片饱和重-叶片干重）；叶片元素含量测定（Lean Nutrients）：全碳、全氮：碳氮分析仪测定；全磷、全钾：HNO3-HClO4消解，HCl溶解，ICP-AES测定（LY/T 1270-1999）；叶片稳定性碳同位素（δ13C）：样品经研磨后过100目筛，准确称量4.000- 5.000mg样品用锡舟包裹放入EA自动进样盘，进行高温燃烧裂解生成CO2，生成的气体经二氧化碳吸附柱最终分离，并由载气He带入离子源离子化后进行检测，设置580秒时通入CO2气体（>99.999%)作为参考气体，持续30秒，通过参考气体与样品气体的检测对比，最终得到13C/12C 的比值。
反应温度：920℃和600℃；叶片长期内禀水分利用效率（iWUE）计算：叶片δ13C值是负的并且与细胞间与环境的时间比呈线性关系，与叶片内的长期水分利用效率（iWUE）正相关。
三、枝条生理性状测定：木材体积（Vwood）：用排水法测量木材体积；木材干重（Wdry）：将干净的剥皮的木材放在烘箱中７０°Ｃ72h，称取其重量；木材鲜重（Wwet）：将采集回来的材料，在电子天平上称量其鲜重；木材饱和重（Wsaturated）：将剥皮的干净的木材放在纯净水中浸泡48h，后用纸将表面的水擦干净后在电子天平中称量饱和重；木材相对含水量（SWCwood）：=木材饱和重-木材鲜重/木材饱和重-木材干重木材密度（Wood density）：=木材干重/木材体积皮厚度：用游标卡尺测量皮的厚度；髓芯大小（面积）：用游标卡尺测量髓芯的直径并计算其髓芯面积植物叶片解剖特征的测定：1.叶片组织石蜡切片制作（见附件一）；2.叶片组织厚度测定（附件二）：叶片厚度，栅栏组织，海绵组织，上下表皮，角质层3.叶片气孔特征：叶片气孔制片（印迹法-指甲油，徒手切片法）；气孔密度，气孔保卫细胞大小，气孔指数（气孔数量与表皮细胞个数的比值）；4.叶脉密度测定：透明叶制作方法；徒手切片法；叶脉密度计算。
如何制作永久植物玻片标本
如何制作永久植物玻片标本石蜡切片（paraffin section）组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。
石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。
活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。
一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
1.取材应根据要求选取材料来源及部位。
例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。
材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。
固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。
固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。
例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。
固定液可分为单一固定液及混合固定液。
前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。
植物制片的一般原理与方法
植物制片的一般原理与方法第一章植物制片的方法及预备植物制片技术是植物显微技术课的一个重要组成部分，在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的讨论和教学工作中，都需要应用显微制片技术，由于各种作物器官的性质差异以及讨论目的的不同，就需要不同的制片方法，但因限于学时及篇幅，本书仅依据常用的基本原理及教学中行之有效的方法加以介绍。
第一节植物制片的基本要求与主要制片方法植物内部结构不能用大而厚的组织块置于显微镜下观看，必需进行制作切片，才能供显微镜下观看应用。
石蜡（或徒手）切片，是将植物切成薄的材料，按下列主要步骤与要求制成永存切片。
1.采样：材料的选择与分割2.杀生、固定与器皿清洗3.冲洗（有的不经此步）4.脱水（各级酒精）5.透亮6.渗透（例如浸蜡）7.包埋（石蜡包埋）8.切片（切片机或徒手切片）9.粘片10.烘片11.脱包埋剂（石蜡）12.经各级酒精（脱水）13.染色14.分色15.脱水16.透亮17.封藏成永存片从上述主要环节来看，首先将材料加以处理（1、2、3项），其次步进行制片基础的处理工作（4、5、6、7项），在保证质量完成这两类工作基础上，方可顺当完成切片工作（包括8、9、10项），也就是说切出符合规格的薄片来，然后再对组织进行染色、脱水、透亮等一系列工作，才可制成透亮清楚、染色艳丽、适合显微镜观看摄影，并作教学、科研长期保存的永存片。
其具体制片过程与方法，在以后章节内加以介绍。
通常制片分两大类型。
其次节溶液的配制（一）各级酒精浓度的配制在植物制片中常用各级酒精，一般以95%酒精来配制，为节省起见，避开用无水酒精来配制各级酒精（表1一2）。
在试验中使用酒精量较大，每次以量筒量液花费时间多，可在500ml细口瓶有玻璃塞的瓶上贴一条宽1cm与瓶等长的白色纸条，仅在第一次用量筒量酒精与蒸馆水的用量处划上刻度，以后每当瓶内溶液用完，即以纸条上刻度分别倒入酒精和蒸馆水的各用量即可。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法
植物制片的染色及显微化学鉴定方法植物制片是植物解剖学研究的基础，主要包括了样品的采集、处理、包埋和切片等步骤。
制片的质量直接影响着后续染色和显微化学鉴定结果的准确性和可靠性。
以下是植物制片的一般步骤：1.采集样品：根据研究需要，采集符合实验要求的植物部件，如叶片、茎、花粉等。
2.处理样品：对采集到的植物样品进行初步处理，如去除杂质、保持新鲜等。
3.包埋样品：将处理后的样品进行包埋，使用适宜的包埋剂，如石腊、低熔点石蜡等。
4. 切片样品：将包埋好的样品进行切片，使用微tome等工具进行切割，制备出适当厚度的切片。
一旦制片完成后，接下来需要进行染色和显微化学鉴定。
染色方法可以增强显微镜下的观察效果，常见的染色方法包括常规染色和特殊染色。
1.常规染色方法：最常用的染色方法是使用苏丹精、碘红等生物染料，用于染色细胞壁、细胞核等常见组织结构。
常规染色方法可以提供植物组织的基本信息。
2.特殊染色方法：特殊染色方法主要用于特定的组织结构或化学物质的染色。
如使用苏木精-伊红染色对木质部和木质纤维进行染色，使用布氏染色对淀粉进行染色等。
显微化学鉴定方法是通过对制片样品进行特定试剂处理，以便于观察和检测特定化学物质的存在与否。
常用的显微化学鉴定方法包括：1.反应性染色：使用生化试剂或化学试剂与组织中的化学物质进行反应，产生特定的颜色或沉淀。
如使用碘酸钾溶液对淀粉进行碘反应形成蓝色物质。
2.酶反应：通过加入适当的酶试剂，使显色底物发生氧化还原反应，形成显色产物。
如使用过氧化氢试剂对过氧化物酶进行酶反应产生氧气和水。
3.化学反应：使用特定化学试剂，对特定化学物质进行识别。
如使用铁氰化钾试剂对根际紧矿质进行化学反应，生成蓝色的沉淀。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法，通过染色和试剂处理等手段，可以使植物组织结构变得更加清晰和可见，从而更好地研究和识别植物的组织结构、化学成分和功能。
这些方法对于植物科学研究和植物学教学有着重要价值。
植物切片制作
植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术,是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分.植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术:徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。
徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。
优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
用品与材料显微镜、载（盖)玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1％番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中,便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块,一般以长2~3cm,切片断面不超过3～5mm2为宜。
对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。
有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片. 实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。
2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。
3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作,自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
4、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中.用毛笔挑选透明的薄片,放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛,不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
3、动作要敏捷,材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。
简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。
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二、杀死、固定、保存
✤固定象 碱性固定象：碱性固定剂可保存 核质和线粒体，细胞质呈透明质 状态，液泡也可保存下来。细胞 分裂间期的染色质、核仁、纺缍 丝被溶解。
二、杀死、固定、保存
固定的成败直接关系到实验结果。
固定的效果 固定好的材料结构清晰，层次分明， 能真实地反应材料的结构特征。
影响固定的因素有以下几种。
以碘液检测是 否清洗干净
三、清洗与脱水
2）脱水 用药剂将材料中的水分置换干净。
作用：
＊硬化材料 ＊便于透明剂、包埋剂的渗入。
三、清洗与脱水
常用的药剂 1）酒精：最常用的脱水剂。
优点：能与水以任意比互溶，方 法简便易学。
缺点：不溶于石蜡等包埋剂；易 使材料硬化，而不利于切片。
三、清洗与脱水
酒精的使用： 使用酒精脱水时，酒精溶液浓度 宜由低到高，逐级进行。 在各级酒精中停留时间，依据材 料的大小、软硬程度而定。坚硬 的和较大的材料时间宜长，柔软 的、较小的材料时间宜短。
绪论
• 植物显微技术的近代发展 多种功能显微镜的使用 电镜技术的发明 多种切片技术的运用 电镜技术
绪论
• 植物显微技术的发展热点 免疫化学与显微技术的结合 分子生物学向显微技术的渗透
植物显微技术
植物制片技术 光学显微镜技术 显微摄影技术
植物制片技术
第一章 概论 第二章 植物制片的步骤原理 第三章 植物制片的各类方法 第四章 植物组织化学的测定
保存：组织或细胞保持生活的状态， 能保存较长时间不发生任何变化。
二、杀死、固定、保存
• 固定的原理
化学作用：凝结作用。如蛋白质 变性。
物理作用：沉淀作用，如油类、 脂肪遇锇酸发生黑色沉淀。
二、杀死、固定、保存
• 理想固定剂具备的特点
1、快速渗入材料，杀死原生质，固定 其细微结构；不因固定等人为因素 发生变化。
概论
• 非切片法： 不同于上述两种制片方法，用化学 药剂处理材料后进行观察。 有离析法、涂抹法、整体封固法、 透明法等。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
植物制片技术原理步骤
五、浸透和包埋
选用石蜡的原则： 夏季或材料质地较为坚硬，选用高熔 点的石蜡；冬季或材料质地较为幼嫩、 柔软，选用低熔点的石蜡为宜。
五、浸透和包埋
包埋器材： 纸船（柔韧的纸折叠而成）、温台、
镊子、酒精灯。
五、浸透和包埋
包埋步骤： （1）熔化的石蜡倒入纸船，镊子夹取
渗透好的材料放入纸船中。 （2）纸船表面的石蜡开始凝结，将其
2、甲醛：分子式为HCOH，是气体。作 为固定剂时，为溶于水的溶液（38%） 来使用。有良好的硬化作用，也有收缩 固定过度，渗透慢的缺点。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
3具、有冰强醋烈酸刺：激分性子气式味为的C无H3色C液OO体H。，是 特点是渗透力强，可防腐，保存蛋白 质和染色体，但溶解脂肪，有膨胀作 用。
放入冷水中，促进石蜡短时间内凝 固。 （3）过夜后，取出备用。
五、浸透和包埋
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
六、切片
（1）修块： 将包有材 料的蜡块 修成一个 上窄下宽 的台体。 粘在木块 上，即可 切片。
绪论
三、植物显微技术发展简史 植物显微技术的诞生与早
期发展，最早可追溯到列文•虎 克的显微镜与发现。方法非常 简陋，材料未经任何处理直接 在显微镜下观察，显微镜的分 辨率也比较低。
绪论
• 植物显微技术的日渐成熟 固定法出现 石蜡切片法的发明 染色方法的使用 早期显微图谱多为徒手绘制 高分辨的显微镜制造使用 照相技术的应用
时。重复一次。可进行包埋。
五、浸透和包埋
包埋：以特定的器皿将材料及石蜡 制成适宜切片的形态。 石蜡性质与切片的成败密切相关。
五、浸透和包埋
包埋剂特点： 石蜡有熔点为52、54、56、58度四种 不同的石蜡。 石蜡熔点不同，性质不同。低熔点的 石蜡质地均一，而56-58度的石蜡质地 较为疏松，有小的空隙，易使蜡带不 成带。
二、杀死、固定、保存
✤使用具有还原性和氧化性的固 定液，中途需更换一次新液。
二、杀死、固定、保存
✤抽真空 植物材料有大量孔隙，适当抽 去其中的气体，有利于材料的 固定。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
三、清洗与脱水
常用的脱水剂
2）正丁醇：
分子式 CH3CH2CH2CH2OH。无色液 体，有酒味。能与乙醇、乙醚及其他 多种有机溶剂混溶。蒸气与空气形成 爆炸性混合物，易燃物。毒性与乙醇 相同，但刺激性强，有使人难以容忍 的恶臭。
三、清洗与脱水
正丁醇的使用：
使用时与酒精以一定比例混合，最后使 用纯溶液。
的4、水铬化酸物：，分为子红式棕为色H晶2C体rO，4强，氧是化Cr剂O3。 可沉淀蛋白、核酸。有收缩、渗透慢、 硬化的缺点。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
5、苦味酸：淡黄色晶体，分子式为C6H2 （NO2）3OH，强烈的爆炸物，以过饱 和水溶液保存。具有渗透力强，沉淀蛋 白、核酸，防硬化，增染色的特性，是 优良的固定剂。
6、锇酸：分子式为OsO4，是灰黄色的 晶体。最好的固定剂，脂类的唯一固定 剂，但渗透慢，易出现固定不均现象。
植物制片技术原理步骤
• 常用固定剂
7、重铬酸钾：分子式K2Cr2O7，橙色结 晶粉末，强氧化剂。 特点：渗透慢，强硬化作用。
8、氯化汞：分子式为HgCL2，剧毒无色 粉末。杀死强，渗透快， 沉淀蛋白，有 强的收缩作用。不单独使用。
• 制片的步骤： 选材固定清洗脱水透明 浸蜡包埋切片粘片脱蜡染 色脱水封固。
先后顺序不可颠倒，环环相 扣。
一、选 材
根据研究和观察的目的确定取材 的部位。
原则是“准、巧、小”。
一、选 材
• 植物材料的切取： 根、茎类轴性器官的切取： 1、横切面：观察各种组织的横切面，及其所 占比例。垂直于长轴方向切取。 2、纵切面：观察各种组织的纵切面，平行于 长轴方向切取。 分为：径向切面和切向切面。
六、切片
旋转切片机
样品台 手柄 刻度盘 刀架
六、切片
六、切片
（2）切片：将蜡块夹在切片机上；调 整刀口，刀刃与蜡块平行；调整刀的 倾角；调整切片厚度；切片。
六、切片
切片时，右 手旋转手柄， 左手拿毛笔， 挑起蜡带， 达到15-20厘 米后用刀片 切断。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
四、透明与过渡
材料除尽水分后，多需要经过 一种既能与脱水剂又能与包埋剂混 合的溶剂处理，以便于包埋剂的渗 入。同时，这种溶剂能使材料变得 透明，因此，该步骤称为透明。
四、透明与过渡
常用的透明剂 1）二甲苯
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
三、清洗与脱水
1）清洗：洗去材料中的固定液。 清洗剂：常用水或酒精溶液。 在操作时，根据固定液来选择。 见下表
三、清洗与脱水
固定液
清洗剂
备注
FAA 同浓度的酒精
纳瓦兴或其 它弱酸类
水
含苦味酸的 70%酒精溶液
苦味酸-甲醛 除外
锇酸类
水
流水冲洗
氯化汞类
水或酒精溶液
2、增加细胞结构及内含物的折光程度， 使之更为清晰，适合显微镜观察。
二、杀死、固定、保存
• 理想固定剂具备的特点
3、组织或细胞不发生收缩或膨胀
4、能增加染色或媒染能力。
5、增加组织的硬度易于切片，但不至 于过于松脆。
6、具有保存作用。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
1、酒精：分子式为C2H5OH，是常用的 有机溶剂，能与水以任意比互溶。是良 好的固定剂，杀死速度极快。缺点：具 收缩作用。
概论
• 目的：
为观察植物内部细微结构，将植物材 料制成适合显微镜观察的薄片。
概论
• 制片分类：
保存时间分：临时制片、永久制片 制作方法分：
活体观察 切片法 非切片法
概论
• 活体观察： 对材料不加任何处理直接观察， 达到镜检目的。
概论
• 切片法： 用刀具将材料切成薄片，进行镜检。 有徒手切片，石蜡切片，塑料切片 等。
一、选 材
• 叶的切取：横切面。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
二、杀死、固定、保存
杀死：迅速终结植物材料的生命。要 求越快越好，使用渗透力强的药剂。
固定：在杀死基础上，组织或细胞保 持生活的状态，并在以后制片的过程 中不发生变化。
9、碘：分子式为I2 ，良好的防腐剂
二、杀死、固定、保存
•混合固定液种类及应用（一）
二、杀死、固定、保存
• 混合固定液种类及应用（二）
二、杀死、固定、保存
混合固定液种类及应用（三）