植物制片技术

一、选 材
• 叶的切取：横切面。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
二、杀死、固定、保存
杀死：迅速终结植物材料的生命。要 求越快越好，使用渗透力强的药剂。
固定：在杀死基础上，组织或细胞保 持生活的状态，并在以后制片的过程 中不发生变化。
优点：省略了透明，直接渗蜡。
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 3）叔丁醇：
分子式(CH3)3COH，樟脑气味的无色 结晶，在少量水存在时则为液体。溶 于乙醇、二甲苯、水。有毒，对中枢 神经系统具有麻醉作用，对皮肤粘膜 有轻度刺激作用。为易燃易爆物。
Baidu Nhomakorabea
三、清洗与脱水
叔丁醇的使用：
逐级进行。 不会使组织收缩或变硬。 省略脱水和透明的步骤。
绪论
三、植物显微技术发展简史 植物显微技术的诞生与早
期发展，最早可追溯到列文•虎 克的显微镜与发现。方法非常 简陋，材料未经任何处理直接 在显微镜下观察，显微镜的分 辨率也比较低。
绪论
• 植物显微技术的日渐成熟 固定法出现 石蜡切片法的发明 染色方法的使用 早期显微图谱多为徒手绘制 高分辨的显微镜制造使用 照相技术的应用
植物显微技术
绪论
一、什么是植物显微技术 用于观察研究植物内部精细结
构的技术方法，包括制片技术、 光学显微镜技术和显微摄影技术， 是一门建立在生物学、化学以及 物理等多门学科基础之上的综合 性技术性学科。
绪论
二、植物显微技术的任务和目的 根据材料的自然特性，观察
和研究的需要，将材料制成适宜 的薄片，选择合适的显微镜，显 示材料正确而清晰的结构，获得 反映材料真实特征的显微照片。
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
三、清洗与脱水
1）清洗：洗去材料中的固定液。 清洗剂：常用水或酒精溶液。 在操作时，根据固定液来选择。 见下表
三、清洗与脱水
固定液
清洗剂
备注
FAA 同浓度的酒精
纳瓦兴或其 它弱酸类
水
含苦味酸的 70%酒精溶液
苦味酸-甲醛 除外
锇酸类
水
流水冲洗
氯化汞类
水或酒精溶液
✤固定的时间 固定剂对不同种类的植物及其不 同器官完成固定的时间不同。 过短，固定不均匀；过长对材料 有不良影响或不易着色。
二、杀死、固定、保存
✤固定液的用量 固定液用量不可太少，为材料 体积的20—50倍为宜。植物细 胞中含有大量水分，会稀释固 定液。
二、杀死、固定、保存
✤材料切取 保持材料新鲜，避免机械损伤。 切割的材料立即投入固定液中。
绪论
• 植物显微技术的近代发展 多种功能显微镜的使用 电镜技术的发明 多种切片技术的运用 电镜技术
绪论
• 植物显微技术的发展热点 免疫化学与显微技术的结合 分子生物学向显微技术的渗透
植物显微技术
植物制片技术 光学显微镜技术 显微摄影技术
植物制片技术
第一章 概论 第二章 植物制片的步骤原理 第三章 植物制片的各类方法 第四章 植物组织化学的测定
• 制片的步骤： 选材固定清洗脱水透明 浸蜡包埋切片粘片脱蜡染 色脱水封固。
先后顺序不可颠倒，环环相 扣。
一、选 材
根据研究和观察的目的确定取材 的部位。
原则是“准、巧、小”。
一、选 材
• 植物材料的切取： 根、茎类轴性器官的切取： 1、横切面：观察各种组织的横切面，及其所 占比例。垂直于长轴方向切取。 2、纵切面：观察各种组织的纵切面，平行于 长轴方向切取。 分为：径向切面和切向切面。
六、切片
旋转切片机
样品台 手柄 刻度盘 刀架
六、切片
六、切片
（2）切片：将蜡块夹在切片机上；调 整刀口，刀刃与蜡块平行；调整刀的 倾角；调整切片厚度；切片。
六、切片
切片时，右 手旋转手柄， 左手拿毛笔， 挑起蜡带， 达到15-20厘 米后用刀片 切断。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
保存：组织或细胞保持生活的状态， 能保存较长时间不发生任何变化。
二、杀死、固定、保存
• 固定的原理
化学作用：凝结作用。如蛋白质 变性。
物理作用：沉淀作用，如油类、 脂肪遇锇酸发生黑色沉淀。
二、杀死、固定、保存
• 理想固定剂具备的特点
1、快速渗入材料，杀死原生质，固定 其细微结构；不因固定等人为因素 发生变化。
的4、水铬化酸物：，分为子红式棕为色H晶2C体rO，4强，氧是化Cr剂O3。 可沉淀蛋白、核酸。有收缩、渗透慢、 硬化的缺点。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
5、苦味酸：淡黄色晶体，分子式为C6H2 （NO2）3OH，强烈的爆炸物，以过饱 和水溶液保存。具有渗透力强，沉淀蛋 白、核酸，防硬化，增染色的特性，是 优良的固定剂。
概论
• 非切片法： 不同于上述两种制片方法，用化学 药剂处理材料后进行观察。 有离析法、涂抹法、整体封固法、 透明法等。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
植物制片技术原理步骤
时。重复一次。可进行包埋。
五、浸透和包埋
包埋：以特定的器皿将材料及石蜡 制成适宜切片的形态。 石蜡性质与切片的成败密切相关。
五、浸透和包埋
包埋剂特点： 石蜡有熔点为52、54、56、58度四种 不同的石蜡。 石蜡熔点不同，性质不同。低熔点的 石蜡质地均一，而56-58度的石蜡质地 较为疏松，有小的空隙，易使蜡带不 成带。
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
七、粘片与展片
七、粘片与展片 使用药剂将蜡带粘在洁净的载玻 片上的步骤，称为粘片。
放入冷水中，促进石蜡短时间内凝 固。 （3）过夜后，取出备用。
五、浸透和包埋
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
六、切片
（1）修块： 将包有材 料的蜡块 修成一个 上窄下宽 的台体。 粘在木块 上，即可 切片。
原则：逐级进行，石蜡的浓度由 低到高。
五、浸透和包埋
步骤： （1）材料浸入2/3的二甲苯、1/3石蜡
的溶液，30-40度过夜。 （2）升温至56度，材料浸入1/2 的二甲
苯、1/2石蜡的溶液，历时2个小时。 （3）材料浸入1/4 的二甲苯、3/4石蜡
的溶液，历时2个小时。 （4）材料浸入纯石蜡溶液，历时2个小
2、增加细胞结构及内含物的折光程度， 使之更为清晰，适合显微镜观察。
二、杀死、固定、保存
• 理想固定剂具备的特点
3、组织或细胞不发生收缩或膨胀
4、能增加染色或媒染能力。
5、增加组织的硬度易于切片，但不至 于过于松脆。
6、具有保存作用。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
1、酒精：分子式为C2H5OH，是常用的 有机溶剂，能与水以任意比互溶。是良 好的固定剂，杀死速度极快。缺点：具 收缩作用。
2、甲醛：分子式为HCOH，是气体。作 为固定剂时，为溶于水的溶液（38%） 来使用。有良好的硬化作用，也有收缩 固定过度，渗透慢的缺点。
二、杀死、固定、保存
• 常用固定剂
3具、有冰强醋烈酸刺：激分性子气式味为的C无H3色C液OO体H。，是 特点是渗透力强，可防腐，保存蛋白 质和染色体，但溶解脂肪，有膨胀作 用。
二、杀死、固定、保存
✤固定象 碱性固定象：碱性固定剂可保存 核质和线粒体，细胞质呈透明质 状态，液泡也可保存下来。细胞 分裂间期的染色质、核仁、纺缍 丝被溶解。
二、杀死、固定、保存
固定的成败直接关系到实验结果。
固定的效果 固定好的材料结构清晰，层次分明， 能真实地反应材料的结构特征。
影响固定的因素有以下几种。
6、锇酸：分子式为OsO4，是灰黄色的 晶体。最好的固定剂，脂类的唯一固定 剂，但渗透慢，易出现固定不均现象。
植物制片技术原理步骤
• 常用固定剂
7、重铬酸钾：分子式K2Cr2O7，橙色结 晶粉末，强氧化剂。 特点：渗透慢，强硬化作用。
8、氯化汞：分子式为HgCL2，剧毒无色 粉末。杀死强，渗透快， 沉淀蛋白，有 强的收缩作用。不单独使用。
概论
• 目的：
为观察植物内部细微结构，将植物材 料制成适合显微镜观察的薄片。
概论
• 制片分类：
保存时间分：临时制片、永久制片 制作方法分：
活体观察 切片法 非切片法
概论
• 活体观察： 对材料不加任何处理直接观察， 达到镜检目的。
概论
• 切片法： 用刀具将材料切成薄片，进行镜检。 有徒手切片，石蜡切片，塑料切片 等。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
五、浸透和包埋
渗透：经过脱水、透明之后，将 包埋介质逐步浸入材料，使之渗入细 胞各部，并与细胞壁紧密结合，这个 过程为渗透。
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 4）丙酮：分子式CO(CH3)2，为无
色透明液体。 脱水快于酒精，仍须经过透明。
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 5）甘油：分子式C3H5(OH)3，无色
透明粘稠液体。 避免原生质的收缩，适用于细小 柔软材料。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
五、浸透和包埋
选用石蜡的原则： 夏季或材料质地较为坚硬，选用高熔 点的石蜡；冬季或材料质地较为幼嫩、 柔软，选用低熔点的石蜡为宜。
五、浸透和包埋
包埋器材： 纸船（柔韧的纸折叠而成）、温台、
镊子、酒精灯。
五、浸透和包埋
包埋步骤： （1）熔化的石蜡倒入纸船，镊子夹取
渗透好的材料放入纸船中。 （2）纸船表面的石蜡开始凝结，将其
以碘液检测是 否清洗干净
三、清洗与脱水
2）脱水 用药剂将材料中的水分置换干净。
作用：
＊硬化材料 ＊便于透明剂、包埋剂的渗入。
三、清洗与脱水
常用的药剂 1）酒精：最常用的脱水剂。
优点：能与水以任意比互溶，方 法简便易学。
缺点：不溶于石蜡等包埋剂；易 使材料硬化，而不利于切片。
三、清洗与脱水
酒精的使用： 使用酒精脱水时，酒精溶液浓度 宜由低到高，逐级进行。 在各级酒精中停留时间，依据材 料的大小、软硬程度而定。坚硬 的和较大的材料时间宜长，柔软 的、较小的材料时间宜短。
二、杀死、固定、保存
✤使用具有还原性和氧化性的固 定液，中途需更换一次新液。
二、杀死、固定、保存
✤抽真空 植物材料有大量孔隙，适当抽 去其中的气体，有利于材料的 固定。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
9、碘：分子式为I2 ，良好的防腐剂
二、杀死、固定、保存
•混合固定液种类及应用（一）
二、杀死、固定、保存
• 混合固定液种类及应用（二）
二、杀死、固定、保存
混合固定液种类及应用（三）
二、杀死、固定、保存
✤固定象 被固定剂保存下来的细胞内物质 及其形态，称为固定象。 酸性固定象：酸性固定剂可保存 细胞分裂间期的染色质、核仁、 纺缍丝，细胞质呈索状海绵状。
二、杀死、固定、保存
✤固定液的选择 根据观察目的和对象，选择固 定剂。同时，要充分考虑植物 种类、不同器官的特性。
二、杀死、固定、保存
✤固定液的渗透力 1）选择固定剂时，要充分考虑 固定液的性质、浓度和温度对 渗透力的影响。 2）植物材料的大小和组织紧密 程度对渗透的影响。
二、杀死、固定、保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
四、透明与过渡
材料除尽水分后，多需要经过 一种既能与脱水剂又能与包埋剂混 合的溶剂处理，以便于包埋剂的渗 入。同时，这种溶剂能使材料变得 透明，因此，该步骤称为透明。
四、透明与过渡
常用的透明剂 1）二甲苯
三、清洗与脱水
常用的脱水剂
2）正丁醇：
分子式 CH3CH2CH2CH2OH。无色液 体，有酒味。能与乙醇、乙醚及其他 多种有机溶剂混溶。蒸气与空气形成 爆炸性混合物，易燃物。毒性与乙醇 相同，但刺激性强，有使人难以容忍 的恶臭。
三、清洗与脱水
正丁醇的使用：
使用时与酒精以一定比例混合，最后使 用纯溶液。