6 基因文库的基本构建

二、 cDNA克隆载体的选择
由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于 cDNA文库构建的载体通常选质粒
A、限制性内切酶消化克隆载体 B、碱性磷酸酶去磷酸化处理
三、 cDNA克隆片段的获得
（一）cDNA第一链的合成
影响反转录效率的因素—反转录酶
若要得到较长的或全长的cDNA转录产物，MMLV 来源的反转录酶要好于AMV来源的反转录酶。
定义：以mRNA为模板，将体外转录产生的cDNA与适当 载体连接后转化受体菌，这种包括特定组织细胞所有 mRNA 信息的cDNA 克隆的集合。
根据mRNA 来源不同： 1、区域持异性cDNA 文库 2、组织特异性cDNA 文库
区域特异性cDNA 文库
mRNA是从含特定动物染色体或其区段的杂交细 胞株分离RNA，反转录合成cDNA后，用特异性Alu 序列为引物进行PCR扩增，旨ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ获得相应染色体或 其片段内基因表达的分布图
DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段
的比率就越低，重组率和完备性也就越高
用常规方法制备的染色体
A
A
DNA的长度一般在100 kb左右
如果先将细胞固定在低融点凝
A
A
胶中，然后置入含有SDS、蛋
白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段
（二）DNA克隆片段的制备
* 蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变 性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离 心以分离不同分子量的mRNA.
2) cDNA的分级分离
* mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前， 通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来.
* 优点： a）避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解 b）增加了获得全长cDNA克隆的概率 c）获得更准确的分级分离效果（分子量）
用黏粒载体建立基因组文库的主要步骤
（三）酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）
YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 TRP1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 Apr 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子
ori
大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb
组织特异性cDNA 文库
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
一、mRNA的提取
（一）mRNA的来源
第六章 基因文库的构建
基因组DNA文库的构建 cDNA文库的构建 差减cDNA文库的构建 基因库与畜禽文库的构建
基因文库的基本概念
基因库与基因文库
基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank） 用分子克隆方法将某种生物或其组织细胞的所有DNA片段插入 适当载体，转化适当宿主菌后进行保存的克隆集合。 根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（插入片段是基因组DNA) cDNA文库（插入片段是以mRNA为模板合成的互补DNA ）
酶切、连接 体外包装
感染细菌 噬菌体空斑
构建λ噬菌体基因组文库的主要步骤
（二）黏粒载体
考斯质粒是一类人工构建的含有 l-DNA cos序列和质粒复制子的
PstI Apr
BamHI Tcr SalI
特殊类型的载体
pHC79
cos site - carrying plasmid
6400 bp
1978年Collins和Hohn发明构建
基因组文库的扩增方法
1、液体培养增殖法
方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养 基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为 25%的甘油）。
缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过 多或过少。
2、影印滤膜培养法
第二节 cDNA文库的构建
第一节 基因组DNA文库的构建
基因文库构建流程
大分子基因组 DNA分离
克隆载体制备 插入片段制备
插入片段与载 体连接
基因组DNA 文库生成
连接产物宿主 菌转化
一、构建基因组文库的载体
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装 载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类） 需使用YAC或BAC载体。
ARS1
CEN4 EcoRI
pYAC4
URA3
TEL BamHI TEL
酵母人造染色体的使用：
TRP Apr
ARS
CEN EcoRI
EcoRI
pYAC4
BamHI URA
EcoRI EcoRI
连接
ori TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
转化酵母菌
用YAC载体建立基因组文库的主要步骤
（四）载体DNA的制备
在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
三、重组DNA分子的产生
将基因组DNA消化片段与经限制性核酸内切酶消化的载 体相连接，从而获得重组子的过程
万个克隆
除了尽可能高的代表性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
六、基因组文库的扩增与保存
缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于 mRNA 5’端的地方的序列出现缺失和重排.
G 5‘ppp’5G OH 3’
NaOH Klenow
S1
煮沸 dNTPs
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
3‘ HOCCCCCCC SalⅠ-GGGGG引物 TTTTTT-NotⅠ引物
3‘ SalⅠCCCCCCC 5‘SalⅠ-GGGGGGG
第一链引物去除 Oligo (dC)加尾
RNA降解
PCR扩增
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’
AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ TTTTTp 5’
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如： Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控
b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
G 5‘ppp’5G 5’
RNaesH
5’
S1 5’ 3’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ DNApol dNTPs
AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’
3、PCR合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5G 3‘ HO
G 5‘ppp’5G 3‘ HOCCCCCCC
–承载20Kb左右外源DNA片断
插入型载体
插入位点 载体长度 37 kb
插入片段大小：
0 - 14 kb （51 – 37）
插入片段
体外包装 体外包装
取代型载体
载体长度 26 kb
最小装载长度 10 kb （36 – 26）
最大装载长度 25 kb （51 – 26）
插入片段 插入片段
体外包装 体外包装
连接效率制约因素： 1、插入片段与噬菌体DNA两臂的物质的量比 2、反应体系中DNA的总浓度
四、基因组文库的产生
将重组噬菌体或黏粒DNA进行体外包装，用产生的噬菌 体颗粒感染大肠杆菌，从而获得重组克隆的过程。
五、基因组文库的大小及代表性
代表性：衡量基因组文库质量的关键指标
ln（1-P） N=
高丰度mRNA：占总mRNA的50%~90% 低丰度mRNA：占总mRNA的比例小于0.5%
选择特定发育阶段或特殊处理的组织细胞
（二）mRNA的提取及完整性分析
（三）mRNA的富集
1) 按大小对mRNA进行分级分离
* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分 子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回 收的得率较低.
ln（1-f）
N—基因组文库克隆总数 P—任一基因被克隆（或存在于基因 文库中）的概率
f—插入片段与基因组DNA长度之比
例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段
的平均大小为15 kb，则构建一个代表性为0.9的基因文库至少需要
45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180
ori
1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段
装载范围为31 - 45 kb
cos
l fragment
粘粒载体的基本特点
能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 不能体内包装，不裂解受体细胞
TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
2、置换合成法：
原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切 口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成 切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚 合酶I 的作用下合成cDNA的第二链. 优点：a）合成cDNA的效率高
MMLV来源的反转录酶经过基因突变后具有更低的 RNase H活性，避免第一链合成过程中RNA/DNA 杂交体中的模板RNA被降解。
三、 cDNA克隆片段的获得
（一）cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5G
mDNA
引物
退火
G 5‘ppp’5G
逆转录酶
dNTPs
G 5‘ppp’5G
cDNA第一链
1．载体DNA的酶切
A、同尾酶BamHI消化克隆载体 B、碱性磷酸酶去磷酸化处理
2．载体DNA的纯化 A、黏粒载体：酚：氯仿抽提 B、噬菌体载体：蔗糖密度梯度离心
二、基因组DNA克隆片段的制备
（一）基因组DNA的提取
为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组
文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的
上述几种载体的最大装载量如下：
质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC
15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb
（一）λ噬菌体载体
插入型载体
– 只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ 噬菌体派生载体
–承载10Kb以内外源DNA片断
取代型载体
– 具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可 被外源DNA片断取代
端，然后与载体相连接，再将重组质粒转化受体细胞。
（四）cDNA与载体的连接
固定载体的用量，将不同比例的cDNA与之连接， 以确定最佳的连接反应条件。
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
（二）cDNA第二链的合成
1、自身引导法：
定义：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠 杆菌聚合酶I Klenow或反 转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.
TTTTTNotⅠ5’ AAAAANotⅠ3’
（三）双链cDNA末端的处理
1.同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3’
端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接 成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞
同聚物加尾法克隆 双链cDNA
2、接头-衔接头法 将含限制性内切酶识别位点的切头（linker）添加在cDNA的末