《禽病学实验》课件

攻毒方式
点眼滴鼻 饮水 肌注 静脉注射 皮下注射 脑内接种
72小时后观察临床症状，剖检看病理 变化，采集病料开展实验室诊断。
实验二 病理解剖和病料采集
实验目的 对人工发病的鸡进行临床症状和病理变化的
观察，并进行病料采集。 实验材料 实验动物:发病鸡 器材:剪刀、密封袋
一常、用目的的要细求菌培养方法
1、需氧菌分离培养法
（1） 平板划线分离法
目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得 纯菌。
方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本。 连续划线法：适用于含菌量较少的标本。
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
鸡胚接种
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病 毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径， 感染病毒的组织和液体中含大量病毒。
二、鸡胚用于病毒培养的优缺点 （一）优点
组织分化程度低，病毒易于增殖 可选择不同的日龄和接种途径 感染病毒的组织和液体中含大量病毒 容易采集和处理 来源充足 设备和操作简便易行
Kary B. Mullis
PCR反应循环
94℃
变性
55℃
退火
PCR循环
72℃
延伸
引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
PCR反应体系
模板：DNA
引物：P1 P2
DNA聚合酶：Taq
原料：dNTP
反应缓冲液 辅助因子：Mg2+
Taq
P2
Mg2+
P1
dATP dCTP
面进行交换。
气室
呼吸和调节压力
绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换
是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透 明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液 中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13 天后，尿囊液开始变得混浊。
羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中 卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。 卵白 在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
七、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上， 冻死胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1、绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2、尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3、卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体
实验五 细菌分离培养及鉴定
一、目的要求被检材料或病料
分离
单个菌落
纯培养
按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂
并混匀：
20μl反应体系（用于检测）：
RT product(CDNA)： 2μl
10*rTaq buffer(with Mg2+): 2μl
dNTP(2.5mM) :
1.6μl
P1(上游引物)（20mM）: 0.2μl
P2(上游引物)（20mM）: 0.2μl
rTaq:
0.2μl
ddH2O:
14μl
以上各组分混匀后在PCR仪中运行相应程序， 再电泳检测或冻存。 注 ：除酶外，其他试剂在室温下融化。扩增 不同的片段用不同的引物，每次都要有对照 管，分别设阳性对照和阴性对照，阴性对照 只加入H2O，不加RT product。
反应程序：
（1）95℃ 5min （2）94℃ 1min （3）53℃ 1min (5)30cycle （4）72℃ 2min （6）72℃ 10min （7）end (1) 步为预热温度。 (2) 为变性温度:解双链，因长度而定。 (3) 为退火温度:依引物G+C含量、长度而定。 (4) 为延伸温度:依扩增片段长度而定。 (5) 为循环数。
纯培养物
移植培养
。。。。。。
接种工具
接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金 属柄和绝缘柄。接种前后都要过火灭菌。接种针用于 穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌 接种。
接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
• 无鞭毛细菌： – 只沿穿刺线生长，穿刺线边 缘清晰。
无动力 现象
有动力 现象
材料
1. 器材：接种环、酒精灯、打火机。 2. 培养基：LB固体培养基。 3. 菌种：未知样wenku.baidu.com。
实验六 PCR试验
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出的一 种体外简化条件下模拟DNA体内复制的 DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年 诺贝尔化学奖。
ＲＴ－ＰＣＲ
逆转录酶
mRNA 杂化双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量。
内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针
脾、肾、喉头、气管、胸腺等
实验三、四 病料的保存和处理、鸡胚接种
病料的保存和处理
活禽气管和泄殖腔拭子等样品；小珍禽采集新鲜粪便；死禽采集气管、 脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。
病料应放在含有抗生素的pH值7.0～7.4的等渗PBS内（无PBS可用25%～ 50%的甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬 液中应含有青霉素（2 000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、丁胺卡那霉素 （1 000 IU /mL）和制霉菌素（1 000IU/mL），但粪便和泄殖腔拭子所 有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。
四、实验材料
1、鸡胚 9-11日龄 2、病毒 NDV H9 AIV 3、照蛋灯 4、打孔器 5、石蜡 6、注射器 7、蛋座 8、酒精棉球、碘酊棉球
五、接种前处理
用检卵灯检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚 胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。
对鸡胚进行消毒。
六、接种途径 1、尿囊腔接种 2、绒毛尿囊膜接种 3、卵黄囊接种
禽病学实验
禽病学实验教学大纲内容
鸡的人工发病试验 细菌分离培养及鉴定
病理解剖和病料采集 PCR试验
病料的保存和处理 鸡胚接种、病毒收获 及病毒鉴定
HA试验 HI试验
实验一 鸡的人工发病实验
实验目的 将鸡只进行人工发病，观察其发病后临床症状和病理变化，
并进行实验室诊断。 实验材料 实验动物:SPF鸡 病原:1mL未知病原（1-6组，病原有差异，可能是混合病原，也 可能是单一病原） 器材:2mL离心管、离心管架、移液器、枪头、1mL注射器
（二）缺点
胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊
髓炎病毒 母源抗体 许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
三、鸡胚的结构与功能
卵壳 壳膜 气室 绒毛尿囊膜
尿囊腔 羊膜与羊膜腔 卵黄 卵白
羊膜腔
卵壳 卵白 尿囊腔
卵壳膜 气室
绒毛尿囊膜
卵壳 上有细孔，进行气体交换 壳膜 使气体分子和液体分子在内外两方
方法二： 1）2）同一 3）将卵横放在卵座上， 胚胎位置向下。在卵长 径的1/2处用碘酊和酒 精消毒。
4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm， 注入病毒液0.1-0.5ml 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵 育，24h内死亡者废弃
（二）绒毛尿囊膜接种 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
dTTP dGTP
循环参数
(1)变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒
(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降
低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
SYBR-Green I
Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
Emission
3’ 5’
SG
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
PCR示例
7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗 中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小 孔用石蜡密封。 8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病
毒、新城疫病毒的分离和增殖。 1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位 2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒 3、用钢锥穿一小孔 4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入 0.1-0.2ml接种物 5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻 卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。
（一）卵黄囊接种法 主要用于虫媒披膜病毒以及支原体和立克次氏体等
的分离和增殖。 方法一： 1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位 置后，垂直放置在卵座上(大头向上)
2）用碘酊和酒精消毒气室端 3）用钢锥在气室中央锥一 小孔
4） 用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小 孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。 5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育， 每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。
引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3）操作简便易行
利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用 电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷 贝的模板序列。
方法一： 1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒 2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口 3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜 4）滴入接种物 5）用胶布或透明胶纸封闭切口
方法二：（要做人工气室） 1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用 电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
在室温放置1～2h后样品应尽快处理，可在4℃存放几天，也可于低温条 件下保存(-70℃贮存最好)。
处理时将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子；粪便、研碎的组织用含抗 生素的pH值 7.0～7.4 的等渗PBS溶液配成10%～20%（W/V）的悬液。样 品液经1 000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。
PCR技术的特点
1 ）高度的灵敏性
PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量， n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。 设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次， 靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增 3355万倍
2）特异性 引物
引物
引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
2、用碘酊和酒精消毒后， 小心用刀尖撬起卵壳，造 成卵窗。 3、在气室端中央钻一个 小孔。 4、用针尖挑破卵窗中心 的壳膜，切勿损伤其下的 绒毛尿囊膜，滴加生理盐 水于刺破处。
5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造 成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷 而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理 盐水迅速渗入。 6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜 上。
连续划线法
一2、、目厌的氧要菌求分离培养法
（1）肝片肉汤培养法 （2）焦性没食子酸法
3、兼性厌氧菌分离培养法
一、目的细要求菌在培养基上的生长表现
1、细菌在固体培养基中的生长现象
• 菌落 – 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单 一肉眼可见的细菌集团。 – 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、 湿润度、黏度、溶血性。
• 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
菌落
菌苔
菌落与菌苔
一、目的要求
2、细菌在液体培养基中的生长现象
• 混浊 • 沉淀：多见于链状排列的细菌。 • 菌膜：多见于厌氧菌。
菌膜 菌沉淀
对照 均匀浑浊
3、细菌在半固体培养基中的生长现象
一、目的要求
• 有鞭毛细菌： – 在培养基中沿穿刺线并向外 扩散生长，穿刺线边缘模糊。
一、外观检查
姿势，鸡冠、鸡脸、眼睛、毛色、皮肤、脚 、肛门等，触摸感觉体温，肌肉
二、肝脏检查
颜色、大小、是否有出血点、坏死点、质地
二、心脏检查
颜色、是否有出血点、是否有包膜、结节
三、肺脏检查
颜色、是否有结节
四、消化系统检查
腺胃乳头、粘膜，肠粘膜、盲肠扁桃体
五、其它部位检查