第05章 代谢物酶法分析技术
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血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
直接法。
wenku.baidu.com
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
18
第五章
代谢物酶法分析技术
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
26
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
系统。
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
V max
以上积分式： t 2.303 Km lg S 0 S 0 S t
S t
V max
St 1% ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]， 若反应达到平衡，假设 S 0
则可简化为：
S 0 Km t 4.606 V max V max
S 0 S 0 S t Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t V max
式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
LD
丙酮酸 + NADH + H+
在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版） 21
第五章
代谢物酶法分析技术
对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性 测定范围等方面都优于传统的化学法
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版） 17
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
25
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
小结与展望
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
4
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第五章
代谢物酶法分析技术
1
代谢物酶法分析的理论基础
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
5
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版） 22
活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法 和速率法的优缺点。
了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的
发展前景。
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版） 2
第五章
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
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第五章
代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
乳酸测定
乳酸 + NAD+
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测
定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
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3
第五章
代谢物酶法分析技术
目
1 2 3 4
录
代谢物酶法分析的理论基础 代谢物酶法分析的方法 代谢物酶法分析的设计要求
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关， Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待 测物越少）则达到平衡所需的时间越短。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
d S ( Km S ) dt V maxS
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。
平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
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第五章
代谢物酶法分析技术
江苏大学 郑铁生
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第五章
代谢物酶法分析技术
教学目标与要求
掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、
酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示 系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。
熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶
若 [S0] <<Km
可简化为：
d S Km dt V maxS
S 0 Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t
若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标
准管与测定管反应时间（t）一致，则有：
lg 标准管S 0 测定管S 0 lg 标准管S t 测定管S t
速度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管 / min Cs 测定管 / min Cu
速率法测定代谢物浓度的原理
前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。
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14
第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
此式是平衡法测定代谢物的基本原理
Cs As Cu Au
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 此公式成立是前提条件 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t
当 [S0]－[St] ≈ [S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基 本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应， 两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
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第五章
代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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12
第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
根据米氏方程：
V maxS v Km S
①当[S] <<Km，则[S] + Km ≈ Km ②当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度Vmax也不变 米氏方程改为：
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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15
第五章
代谢物酶法分析技术
平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
v V max S K S Km
符合一级酶促反应
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
标准管v 标准管[ S ] 测定管v 测定管[ S ]
若同时带标准管，则有：
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，
6
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
V maxS v Km S
米氏方程
改写为 v
d S V maxS dt Km S
d S ( Km S ) dt V maxS
d S (
Km 1 ) dt V maxS V max
可简化为：
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来 表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示
为Cs和Cu。
Cs As Cu Au
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标准管S 0 测定管S 0 标准管S t 测定管S t
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代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
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第五章
代谢物酶法分析技术
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
系统。
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V max
以上积分式： t 2.303 Km lg S 0 S 0 S t
S t
V max
St 1% ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]， 若反应达到平衡，假设 S 0
则可简化为：
S 0 Km t 4.606 V max V max
S 0 S 0 S t Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t V max
式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度。
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代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
LD
丙酮酸 + NADH + H+
在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
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第五章
代谢物酶法分析技术
对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性 测定范围等方面都优于传统的化学法
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
25
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
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小结与展望
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代谢物酶法分析技术
1
代谢物酶法分析的理论基础
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
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5
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
A B C
Ea Ei
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
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活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法 和速率法的优缺点。
了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的
发展前景。
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第五章
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
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代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
乳酸测定
乳酸 + NAD+
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测
定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
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目
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代谢物酶法分析的理论基础 代谢物酶法分析的方法 代谢物酶法分析的设计要求
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关， Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待 测物越少）则达到平衡所需的时间越短。
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(1)
平衡法基本理论
d S ( Km S ) dt V maxS
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
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代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。
平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
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第五章
代谢物酶法分析技术
江苏大学 郑铁生
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第五章
代谢物酶法分析技术
教学目标与要求
掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、
酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示 系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。
熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶
若 [S0] <<Km
可简化为：
d S Km dt V maxS
S 0 Km t 2 . 303 lg 积分得： V max S t
若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标
准管与测定管反应时间（t）一致，则有：
lg 标准管S 0 测定管S 0 lg 标准管S t 测定管S t
速度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管 / min Cs 测定管 / min Cu
速率法测定代谢物浓度的原理
前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。
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代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
此式是平衡法测定代谢物的基本原理
Cs As Cu Au
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 此公式成立是前提条件 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t
当 [S0]－[St] ≈ [S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基 本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应， 两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
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代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
根据米氏方程：
V maxS v Km S
①当[S] <<Km，则[S] + Km ≈ Km ②当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度Vmax也不变 米氏方程改为：
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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代谢物酶法分析技术
2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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15
第五章
代谢物酶法分析技术
平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
v V max S K S Km
符合一级酶促反应
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13
第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
标准管v 标准管[ S ] 测定管v 测定管[ S ]
若同时带标准管，则有：
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，
6
第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
V maxS v Km S
米氏方程
改写为 v
d S V maxS dt Km S
d S ( Km S ) dt V maxS
d S (
Km 1 ) dt V maxS V max
可简化为：
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来 表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示
为Cs和Cu。
Cs As Cu Au
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标准管S 0 测定管S 0 标准管S t 测定管S t
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代谢物酶法分析技术
(1)
平衡法基本理论
标准管S 0 标准管S t 标准管S 0 S t 测定管S 0 测定管S t 测定管S 0 S t