核酸探针技术在食品检测中的应用

科目：食品生物技术导论

学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术

班级：090551

学号：09055106

姓名：黄菁

核酸探针技术在食品检测中的应用

摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。

关键词：食品检测核酸探针基因工程

The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing

Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction.

Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering

正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义

食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。

生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。

生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。

二、核酸探针技术

化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互

作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。

(一) 核酸探针的种类

1.按来源及性质划分

可将核酸探针分为基因组 DNA 探针、cDNA 探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组 DNA 探针和 cDNA 探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA 探针。将 RNA 进行反转录，所获得的产物即为 cDNA。cDNA 探针适用于 RNA 病毒的检测。cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。

将信息 RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便且 RNA 极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个 bp 的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。

2.按标记物划分

有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有 32P、3H、35S。其中，以 32P 应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到 Pg 级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。

目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛

(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。

(二) 核酸探针的标记

1.放射性同位素标记法

常将放射性同位素如 32 P 连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。切口平移法 (nick translation) 是利用大肠杆菌 DNA 聚合酶 I (E.coli DNApolymerase I) 的多种酶促活性将标记的 dNTP 掺入到新形成的 DNA 链中去，形成均匀标记的高比活DNA 探针。

2.非放射性标记法

可将生物素、地高辛连接在 dNTP 上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链 DNA 及 RNA 的标记，探针可在-20℃下保8-10 个月以上。除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过 PCR 反应直接完成。

(三) 核酸杂交

杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称 NC 膜)或尼龙膜(nylon membrane)。

固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。