离子交换层析柱和填料选择指引

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离子交换层析柱和填料选择指南

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一般信息

离子交换层析的原理

离子交换（IEX）层析能够分离电荷只有轻微差别的一分子或组分子。以保证分离是基于带电分子与带相反电荷的层析填料之间的可逆相互作用。通常情况

下，选择条件被感兴趣的分子随着上样柱上而结合到层析填料然后改变条件以便使被结合的物质被洗脱。经常通过连续梯度或逐步增加离子强度进行洗脱，最常使用NaCl。图1显示典型的高分辨率梯度洗脱。阶段洗脱如图3所示。

]

l

C

a

N

[

柱体积（CV）

1 M

5 CV

不结合的分子在

梯度开始前被洗脱

高盐洗涤

平衡梯度洗脱

样品

上样体积

再平衡

洗涤

5–10 CV

5–10 CV

10–20 CV

紧密结合

的分子在

高盐洗涤

中被洗脱图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。

蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p H，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX 以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。图2显示如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数之一）。

离子交换剂的选择

以强交换剂(Q, S, SP)开始，能够在广泛的pH范围进行开发工作。如果感兴趣蛋白的等电点低于pH 7.0或未知，则使用强阴交换剂（Q）结合蛋白。

当在一个极端pH下出现最大分辨率，而且感兴趣的蛋白质在此pH下稳定时，使用强交换剂。

如果强的离子交换剂的选择性不理想，则考虑使用弱的交换剂(DEAE, ANX, CM)，但请记住弱的离子交换剂的离子交换能力随着pH而变化。

多峰配体(MMC, adhere)提供离子相互作用、氢键和疏水相互作用。MMC表现的如同弱的阳离子交换剂，但可以在高电导率下结合。Adhere表现为强阴离子交换剂。

层析柱填料选择

根据纯化步骤的目标和起始材料的条件选择离子交换填料。其他因素例如样品稳定性、规模、速度、结合能力和提供的设备也可能影响最后的选择。一般信息选择性和缓冲液pH

图2显示pH对选择性的影响。三种假定蛋白在不同pH 下的分离如下所述，在图中阐明四种情景（见编号的箭头）。

酸性最强pH：所有三种蛋白都处于它们的等电点，带正电荷，且只结合阳离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱下来。

较小酸性pH：蓝色的蛋白在其等电点以上，带负电荷，而其他蛋白仍然带正电荷。蓝色蛋白结合阴离子交换剂，并可以与直接洗涤穿透的其他蛋白分离。另外，红色和绿色蛋白可以在阳离子交换剂上被分离，而蓝色蛋白洗涤穿透。

碱性最强pH：所有三种蛋白都高于它们的等电点，带负电荷，且只结合阴离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱。

较小碱性pH：红色蛋白低于其等电点，带正电荷。红色蛋白结合阳离子交换剂，而其他蛋白洗涤穿透。

另外，蓝色和绿色蛋白可以在阴离子交换剂上进行分离，而红色蛋白洗涤穿透。

图2. pH对选择性的影响（洗脱模式）。

样品制备

为了获得最佳的分离并避免层析柱性能的退化，正确的样品制备是必要的。样本必须是澄清的，无颗粒物质。

为了去除颗粒物质，过滤（过滤器孔径见缓冲液配制）或离心（10000 g，15分钟）样品。脱盐样品使用HiTrap™ Desalting 5 ml（体积达到1.5 ml）或HiPrep™ 26/10 Desalting（体积达到15 ml）转换为所选择的其实缓冲液。在高盐浓度下不含主要污染的非常小体积的样品可以用起始缓冲液稀释，以降低盐浓度到不干扰填料的水平结合。

层析柱准备

在使用任何IEX填料前洗掉保存溶液和防腐剂。

使用预装层析柱以保证最好的性能分离效果和可重复的结果

所需要的填充床体积是由待纯化样品的量和填料的结合容量决定。装柱，层析柱将具有超过所需要结合容量大约5倍的结合容量，柱床高度达到20 cm。

缓冲液配制

有关挥发性和非挥发性缓冲系统的建议见表1。

缓冲离子应该具有与IEX填料上功能基团相同的电荷，pKa值在工作pH的0.6 pH内。

使用的缓冲液浓度足以维持缓冲能力和恒定的pH，一般为20–50 mM。

在所有盐和添加剂被加入后过滤缓冲液，并始终使用高质量的水和化学试剂。对于颗粒大小> 90 μm使用1 μm滤膜，对于34 μm颗粒使用0.45 μm滤膜，或者对于颗粒大小< 15 μm，或当需要无菌或需要极其干净的样品时使用0.22 μm滤膜。

为了避免气泡产生，确保层析柱和缓冲液在相同温

度下。

对于具有未知电荷性质的样品，请尝试下列条件：- 阴离子交换（Q）

起始缓冲液：pH 8.0

洗脱缓冲液：含有1 M NaCl的起始缓冲液，pH 8.0 - 阳离子交换（S或SP）

起始缓冲液：pH 6.0

洗脱缓冲液：含有1 M NaCl的起始缓冲液，pH 6.0方法开发与优化（按照优先顺序）

通过测试一系列PH值寻找最佳PH，在这些PH值中感兴趣的蛋白质是稳定的。如果目标蛋白的等电点已知，则以更窄的pH范围开始，例如可以从离等电点0.5–1 pH单位。

如果需要，使用自动化填料搜索程序搜索最佳选择性（测试强或弱的交换剂）。

搜索在选定pH下提供合格分辨率的最陡梯度。

搜索保持分辨率和尽可能减少分离时间的最高流速。检查对于待定填料的推荐流速。

搜索可以上样同时维持满意的分辨率的最大上样量。通常，上样20–30%层析柱总结合容量提供采用梯度洗脱的最佳分辨率。

6.对于大规模纯化，通过转变为图3所示的阶段洗脱可以减少分离时间和缓冲液消耗。

5–10 CV

5–10 CV ]

l

C

a

N

[

层析柱体积（CV）

平衡再平衡样品

进样体积

不结合

分子洗脱

不要的

物质洗脱

目标

分子洗脱

紧密结合的

分子洗脱

高盐洗涤

1 M

图3.使用阶段洗脱的典型IEX分离

层析柱清洗

样品和缓冲液的正确制备和每次分离结束时高盐洗涤的应用应该能够保持大多数层析柱在良好的条件。然而，性能降低、流速变慢、背压增加或完全堵塞都是填料需要被更严格的条件清洗以去除污染物的种种表现。

建议在层析柱清洗期间逆向流动，以便使污染物不需要通过整根层析柱。对于每个清洗步骤所需要的柱体积数和时间根据污染程度而变化。如果去除普通污染物的清洗程序不能恢复层析柱的性能，则在尝试另一种清洗方法前先更换顶部过滤器（如果可能）。当更换过滤器时要小心，因为这可能影响柱装填和干扰性能。