核酸的分离纯化

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核酸的保存
DNA DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液，-20 ℃或-70℃保存； RNA ① RNA样品溶于三蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可溶于0.1%DEPC水中。
*TE缓冲液(pH8.0)：
Tris-EDTA buffer(100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0)
生物化学教研室 刘洁
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核酸的分离与纯化
基因克隆技术


DNA测序技术
聚合酶链反应技术 核酸分子杂交技术 蛋白质组学研究技术 生物芯片技术
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核酸的分离与纯化

核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而
存在。
DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量 DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DΒιβλιοθήκη BaiduA
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质粒抽提试剂盒
采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下， 使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱 上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实 现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精 沉淀，12个样品只需不足30分钟即可完成。
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RNA的分离与纯化
核酸的纯化
杂质主要包括三部分：
①蛋白质等大分子污染物；
②其它核酸分子；
③分离纯化过程中加入的对后续实验有影
响的溶液和试剂。
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分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质 分开，同时避免核酸降解。 一般采用方法是：酚/氯仿抽提。 其原理：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质 变性剂，以增加去除蛋白质的效果。因为酚虽然 可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制DNase 的活性。氯仿能加速有机相与液相分层。在氯仿 中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操 作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提是为了去除 核酸溶液中的痕量酚。
RNA是分子生物学的主要研究对象。其分离纯化 主要包括总RNA与mRNA的分离与纯化。 RNA分离与纯化的关键是：防止RNase对 RNA
的降解。
①去除外源性RNase的影响，
创造一个无RNase的环境；
②抑制内源性RNase的活性；
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28s 18s
5s、5.8s等
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总RNA的分离——Trizol试剂
Trizol是一种用于细胞或组织总RNA抽提的试剂。 Trizol可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的 降解。 抽提所得RNA无DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于 DEPC水后的A260/280值为1.6-1.8。 抽提两个样品约需一小时。每一百万细胞用Trizol抽提可得515µ g RNA；每毫克组织用Trizol抽提可得1-10µ g RNA。产 量因细胞和组织不同而异。 Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern，点杂交，纯化 mRNA，cDNA克隆，RT-PCR等；也可以用于基因表达芯片 分析、高通量测序(deep sequencing)等对RNA质量要求较高 的情况。


避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸； 抑制DNase或RNase的活性；
2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染，保证 核酸样品的纯度。
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核酸分离提取的基本步骤
Step 1 Step 2
Step 3
Step 4
细胞的破碎： 物理方法 核酸的 溶胀和自溶 纯化 化学方法 生物酶降解
*DEPC水： 焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理的水。
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注意事项
材料新鲜。尽量简化操作步骤，缩短提取时间，减少 有害因素对核酸的破坏； 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸，过碱对磷 酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行； 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力和高 温。0~4℃的温度环境降低核酸酶的活性与反应速率， 减少对核酸的生物降解； 防止核酸的生物降解，主要是指细胞内、外的各种核 酸酶。如DNase需要金属二价离子Mg++，Ca++的激活， 使用金属二价离子螯合剂EDTA柠檬酸盐，基本可以抑 制DNase活性。
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酚 仿 抽 提 乙 醇 沉 淀 保存
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STEP 6
Water phase (DNA) proteins precipitate chloroform /isoamyl alcohol (lipids) Water phase(DNA)
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核酸的鉴定与分析
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用乙醇沉淀收集DNA。
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操作步骤
溶 胀 细 胞
破核膜 变性蛋白
1. 2.
取新鲜抗凝血3ml， 离心3000 rpm×5 min，弃上清，留沉淀。 加5倍体积ddH2O ，充分振荡，室温静置5min，离心6000rpm×7 min，留 沉淀。（重复两次）
3.
4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Apa LI (178)
质粒作为携带外源基因 在细菌中克隆或表达的 重要载体，在基因工程 中具有极其广泛的应用 价值。
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P(BLA)
Apa LI (2367)
ALPHA
EcoRI (397) AvaI (413) Xma I (413) Sma I (415)
APr
pUC19
Bam HI (418) Pst I (440) Hin dIII (448)
于1.8~2.0之间 1）若RNA样品A260/A280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
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溴乙锭荧光法
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱 基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下， 可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。 使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。该法灵敏度可达 1~5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。
2686 bp
P(LAC) ORI
Apa LI (1121)
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质粒的提纯方法较多：
碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS
——最常用的提取质粒的方法
煮沸法: 沸水煮沸40秒 ——只用于小于15kb的小质粒DNA制备 SDS法：10%SDS ——适用于大于15kb的大质粒DNA制备 试剂盒：简便、快速、抽提效率高
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核酸的鉴定 紫外分光光度法
原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可 以吸收紫外线，最大吸收波长为260nm，利用这 一特性可定量溶液中的核酸浓度。 结论：
1.000A
1.000A 1.000A
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260nm 260nm 260nm
= 50μg/ml ds-DNA
= 40μg/ml ss-RNA = 33μg/ml ss-DNA
注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
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外周血白细胞DNA的提取
1. 溶胀：双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释
放出血红蛋白及细胞核。
2. 破核膜：STE裂解液、SDS、蛋白酶K等破坏
核膜，使蛋白质变性并降解，核蛋白体被破坏。
3. 抽提：酚/氯仿作用使蛋白质与DNA分离。
4. 离心后DNA存在于上层水相中。在高盐环境下，
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核酸的沉淀、浓缩
沉淀是浓缩核酸最常用的方法
优点
①改变核酸的溶解缓冲液种类；
②重新调整核酸的浓度；
③去除溶液中某些盐离子与杂质。
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沉淀核酸常用的盐和有机溶剂
盐类： NaAc、 KAc、 NH4Ac NaCl 、 KCl、 MgCl2 有机溶剂： 乙醇、异丙醇、聚乙二醇
（cpDNA），质粒DNA。

RNA 主要存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含DNA，或 只含有RNA）。
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分离纯化核酸总的原则 :
1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研 究核酸结构和功能的基础；

减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
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测定结果分析 1、测DNA：纯的DNA样品A260/A280应为1.8
1) A260/A280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；
注：
可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比
值为1.8的情况。
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2、测RNA：纯的RNA样品其A260／A280应介
量的对数值成反比。
电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成
一种荧光络合物，在254~365 nm紫外线照射下
可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
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质粒DNA的提取与纯化
质粒(Plasmid) 是染色体外小型（1-200kb）的 共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复 制并能稳定遗传的遗传因子。
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操作步骤
1. 组织匀浆：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50mg80mg组织加入1ml Trizol，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况， 推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入 Trizol进行总RNA抽提。 2. 室温放臵5分钟，使样品充分裂解。 3. 每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放臵 2-3分钟。 4. 12,000g 4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的 离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。 5. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分 钟。 6. 12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。 7. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)，vortex或颠倒混 匀。 8. 7,500g 4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心 1秒），小心吸尽液体。 9. 待RNA略干后，加入20μl DEPC水溶解，-70℃冻存。
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核酸的定性、定量分析 核酸凝胶电泳 核酸杂交技术 多聚酶链反应技术 DNA测序
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DNA的琼脂糖凝胶电泳
DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分 子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小 及构象差别而呈现迁移位臵上的差异。
对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子
生理盐水3ml，平衡沉淀物，室温静置5min，离心6 000rpm×7 min，洗涤 沉淀两次。转移入1.5ml EP管中。
加入450μl STE裂解液和50μl10%SDS，充分混匀，再加入10mg/ml蛋白酶 K 10μl，混匀，55℃水浴1h。 加入Tris-饱和酚500μl，颠倒混匀10min。 离心10 000rpm×6 min ，转移上层水相于一新EP管中。 加入等体积（1:1）酚和氯仿各500 μl， 缓慢颠倒混匀10min ，离心4 000 rpm×5min，取上清。 加入1/10体积3mol/LNaAc（pH5.2），2-3倍体积无水乙醇，充分混匀， DNA呈絮状沉淀。 离心12 000 rpm×10 min，弃上清，加1ml75%乙醇，振荡1min洗涤DNA。 离心12 000 rpm×5 min，弃上清，室温干燥。 加入50μl TE缓冲液溶解DNA。
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紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤
1.吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后 （3ml），转入分光光度计的石英比色杯中。 2.分光光度计先用一定量的水校正零点。 3.测定待测样品在260nm和280nm的吸光度值。 4.计算浓度。 ds-DNA (μg/μl) = A260×核酸稀释倍数×50/1000 ss-RNA (μg/μl) = A260×核酸稀释倍数×40/1000 5.分析纯度。
核酸的 浓缩和 沉淀
核酸的 保存
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细胞的裂解
物理法：煮沸、冻融、微波、超声波、匀浆、液 氮研磨等，这些物理操作可能导致DNA链的断裂。
化学法：高盐、表面活性剂SDS、热酚法等。
酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等，此方法
较为温和，可获得大分子量的DNA。
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