免疫共沉淀技术

研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白
• P53基因为一种人体抑癌基因人体癌症发生约 一半由于该的基因突变失活。 • 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共 沉淀 • SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 • 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串 联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的 肽序列标签 • 搜索数据库 分析目的蛋白相关数据
Part 3:CO-IP与质谱分析
质谱分析
质谱法(Mass Spectrometry, MS) ，即用电场和磁场将运动的离子（带电 荷的原子、分子或分子碎片）按它们的 质荷比分离后进行检测的方法。测出了 离子的准确质量，就可以确定离子的化 合物组成。
Part 3:CO-IP
CO-IP与质谱分析
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳 分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和 抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反 应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特 异性是问题。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必 须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出 抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。 缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
实验室讨论
免疫共沉淀技术
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Part 1:
Part 2:
IP
CO-IP
Part 3: CO-IP与质谱分析 Part 4: 应用 THE END
Part 1:IP
免疫沉淀定义
免疫沉淀（immunoprecipitation IP） 是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白 的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结 合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合 体系沉淀下来。
缺 点
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用 2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而 可能有第三者在中间起桥梁作用； 3. 如用western blot检验，必须在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，若预测不正确，实验就得不到结果， 实验本身具有冒险性。
实验的关键
THE END
Thank you
Part 1:IP
免疫沉淀步骤
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的 蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）， 通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目 的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电 泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还 原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集 上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的 杂蛋分析流程
Part 4: 应 用
3XFlag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7 细胞中的表达与定位
• hPAK4为人P21活化激酶4，构建其 3XFLAG-hPAK4真核质粒
• 转染COS-7细胞。 • 裂解细胞后用anti-Flag抗体免疫沉淀细胞裂解 液，沉降hPAK4蛋白。 • WB鉴定被沉降的目的的蛋白表达。
Part 1:IP
免疫沉淀原理图解
Part 2:CO-IP
免疫共沉淀定义
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation， CO-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用 为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方 法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性 相互作用的有效方法。
Part 2:CO-IP
免疫共沉淀原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免 疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能 沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋 白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
Part 2:CO-IP
血吸虫抱雌沟蛋白与幼虫巨大致死基因作用
• • • • 构建p3XFLAG-GCP 和pCMV-myc-LGL质粒 两质粒共转染293T细胞 SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 用anti-Flag抗体共沉淀 LGL蛋白，用anti-myc 抗体验证。
家蚕微孢子虫胞壁蛋白单克隆抗体 靶蛋白的分离与质谱鉴定分析
免疫共沉淀原理图解
Part 2:CO-IP
IP CO-IP C C A A+B D
蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱 抗B抗体D进行验证
优 点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； 2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响； 3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
• 利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，WB鉴定分 别G10识别虫体蛋白的三种成分，B10识别55KD 左右一种成分。 • 裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共 沉淀 • 切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱 （LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标 签 • 鉴定得出结论G10识别的70KD左右条带为热休克 蛋白70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析 得到其相关信息