阪崎肠杆菌污染途径

• 检验流程: ①接种缓冲蛋白胨水 : • ②mLST增菌24h • ③接种DFI培养基,37℃，培养 24h • ④接种API20NE
1.3 分离方法 DFI显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上
蓝绿色菌落
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
• 样品修复培养（前增菌）： 样品修复培养（前增菌）：无菌称取100g乳粉加 ）： 入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培 养18-24h。 • 样品肠道增菌培养 样品肠道增菌培养：移取10ml 加入90mlEE肉 汤中，于36℃±1℃培养18-24h。 • 样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别 样品分离培养： 划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置 36℃±1℃培养18-24h。观察3种平板上的菌落 形态及不同的生物学特性反应及其差异比较。
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
更快的检测方法? 更快的检测方法
• PCR • Q-PCR
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
荧光PCR结果 结果 荧光
1.4其他肠杆菌属的检验 其他肠杆菌属的检验
• E-M-S法 • 所需培养基： • EMB • MacConKey • SorbitolMacConKey
1.3 分离方法 美国FDA 法 – 2002年 美国 年
• 对加拿大法进行了修改:
– 从10毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（EE）。 毫升接种到90毫升肠杆菌增菌肉汤 毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（ ）。 孵育过夜而不是直接涂布 平板. 在36oC孵育过夜而不是直接涂布 VRBG 平板 孵育过夜 – 可疑菌落接种 可疑菌落接种TSA 并在 oC 培养 48-72 hours. 并在25 – 只有产黄色色素的菌落进行 API 20E system实验 实验. 实验
• 研究了8例与阪崎肠杆菌相关的新生儿脑 膜炎。 • 阪崎肠杆菌从配方奶粉中分离出。 • 然而，没有关于对奶粉中阪崎肠杆菌的数 量分析报告。
1.1发现历史 发现历史
1984 – Postupa and Aldova
• 描述了从奶粉分离出4株阪崎肠杆菌和婴儿 配方奶粉中分离出2株。 • 在脱氧-柠檬酸琼脂37oC孵育48小时。 • 对数量没有详细分析。
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
(A) 假阴性;E. sakazakii FSM 322:非典型菌落
(B)假阳性; 志贺式菌S. ficaria
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
DFI培养基灵敏度 培养基灵敏度
• 可以检测阪崎肠杆菌的水平远低于粮食和 农业组织（粮农组织）建议的 3.0CFU/100g的婴儿配方奶粉。 • 检测水平是0.36/100g
食品中阪崎肠杆菌及其他肠杆菌属的检验
2010.12.24
引言
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)作为 新发现的寄生于人肠道的条件性致病菌，导 致新生儿出现脑膜炎、败血病、小肠结肠炎 坏死等症状，致死率可高达80％。 因此，我们对阪崎肠杆菌进行详细的讨论。
1.食品中阪崎肠杆菌的检验
1.2 流行病学特征 • CRAVEN et al. (2010) 和 HEIN et al. (2009)调查了阪崎肠杆菌在奶粉工厂的非 加工和加工环境的空间分布，流行特点和 持久性。 • 调查结果显示空气是阪崎肠杆菌潜在污染 来源，并确认阪崎肠杆菌在奶粉工厂广泛 的分布
• 阪崎肠杆 菌在乳粉 加工设备 中的分布 • ○：阳性 样品分离 处
• 1.1发现历史 • 1.2流行病学特征 • 1.3检验方法 • 1.4其他肠杆菌属的检验
1.1发现历史 发现历史 • 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)作 为寄生于人和动物肠道的条件性肠道致病 菌，导致新生儿出现脑膜炎、败血病、小 肠结肠炎坏死等症状，致死率可高达80％。 • 一项由7个国家参与的国际调查显示从27种 食品中均分离出阪崎肠杆菌，其中高达 12%原产婴儿奶粉中均检出阪崎肠杆菌
淡粉色1.8-2.5mm
无色或淡黄色1.8-2.5mm
淡粉色1.8-2.3mm
无色或淡黄色1.8-2.3mm
紫红色2-3mm
粉红色2-3mm 粉红色3-4mm，中 间有黄色色素 红色2-3mm
红色2-3mm
紫红色粘液状,3-4mm 紫绿色,有金属光泽, 有黑心2-3mm
红色3-4mm
红色2-3mm
表（1) 所分离的肠杆菌科细菌在 种分 所分离的肠杆菌科细菌在3种分 离培养基上生物学特性反应差异比较
菌株 标准号） （标准号） 阪崎肠杆菌 NCCDC（4株） 聚团肠杆菌 NCCDC（5株） 阴沟肠杆菌 NCCDC（5株） 肺炎克雷伯氏菌 NCCDC（9株） 大肠埃希菌 NCCDC（4株） EMB 紫红色粘液状，相邻 菌落之间易于融合 紫红色1.8-2.3mm MacConKey SorbitolMacConKey
1.1发现历史 发现历史
阪崎肠杆菌(E. sakazakii)的发现历史 的 • 在空气过滤器和受污染的产品可能存 在微生物污染的奶粉蛋白加工设施进 行了调查。在10个月期间，7个空气 过滤器，环境，粉状产品有阪崎肠杆菌 的存在。
1.1发现历史 发现历史
Байду номын сангаас
1983 - Muytjens et. al.
subcultured to TSB-YE agar.
– ③API-20E confirmation. No additional
biochemicals.
• Levels determined by MPN. • 灵敏度为0.36/100g.
1.3 分离方法
加拿大法的调查结果
• 120份样品中,8株阪崎肠杆菌被分离出, 8份样品来自 5 家制造商, 存在数量为 0.36 MPN/100 g.
1.3 分离方法 加拿大法:1997年 – Nazarowec-White 年 加拿大法 and Farber
• 对 Dr. Muytjens’的方法进行了修改: – ①Dried infant formula suspended in sterile water. – ②Suspect colonies from VRBG plates
1.1发现历史 发现历史
IVERSEN et al.2008
• 2008年,阪崎肠杆菌正式从
肠杆菌属中划出,并命名为 克落诺菌属(Cronobacter) • 克落诺菌属目前包括了6个 种
1.2 流行病学特征 • 流行病学调查表明：婴幼儿配方奶粉被认 为是阪崎肠杆菌的主要来源的 • 阪崎肠杆菌最初以婴儿配方奶粉作为传播 媒介，导致新生儿出现脑膜炎、败血症、 肠结肠炎肠坏死， 病死率达 80%以上
• 不需要其他的生化实验 • 灵敏度为0.36/100g.
1.3 分离方法
左，未混合；右，混合
1.3 分离方法
VRBG 平板:典型菌落为紫黑色
1.3 分离方法
TSA 平板: 典型菌落有黄色色素
1.3 分离方法
2003-DFI显色培养基法 标准方法 显色培养基法(标准方法) 显色培养基法
• Druggan-Forsythe-Iversen (DFI)