腺病毒载体的构建

腺病毒载体的构建

第四章socs2腺病毒载体的构建1

由第三章结果可知，基础状态下socs2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是gh可以诱导socs2稳定高表达。socs2高表达的同时，gh诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。为了研究socs2对gh调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现socs2在脂肪细胞中持续高表达。细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(vorburgersaandhuntkk2002)。另外腺病毒载体系统中padeasy系统操作比较简单(luojyetal.2021)。本章克隆socs2基因，采用padeasy系统构建pad-socs2载体，为socs2在脂肪细胞中高效表达，研究socs2对gh调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。

4.1.1样品、菌株、质粒及细胞株

脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；e.colidh5α菌株由本实验室保存；padtrack-cmv和padeasy-1质粒，e.colibj5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株hek293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。

4.1.2主要试剂

限制性内切酶bglⅱ、xhoⅰ和蛋白marker购自fermentas公司；内切酶pmei和paci购自neb公司；pmdtm18-t克隆载体、碱性磷酸酶cipa购自takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自bioflux公司；

λ/hindiiimarker购自天根公司；optimem优化培养液购自gibico公司；脂质体lipofectaminetm2000购自invitrogen公司。载体测序和引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成，其余材料和试剂来源同3.1。

4.2试验方法

4.2.1socs2基因克隆

4.2.1.1非政府中总rna抽取