新生大鼠脑组织中线粒体的分离_刘彤

方法分离出新生大鼠脑组织中的线粒体 , 电镜观察 线粒体的超微结构形态具有完整的线粒体外膜和发 育良好的线粒体嵴 , 线粒体的密度很高且形状不同, 呈球形 和椭 圆形。在所 有的 线粒体 样品 中, 中层
* 通讯作者
中国实验诊断学
2011 年 6 月 第 15 卷 第 6 期
1007 用 Percoll 梯度法 来分离新生大鼠脑组 织中的线粒 体是一种快速有效的方法[ 3- 5] , 它可以得到纯度和 产率较高的线粒体。并通过电子显微镜对新生大鼠 脑组织中的线粒体进行形态观察得以验证。 在成年大鼠脑组织线粒体的制备中, 大多数线 粒体沉淀在了第三层 ( Percoll26% - 40% ) 。在新生 大鼠脑组织线粒体的制备中 , 使用相同的密度梯度 离心 , 大多数线粒体沉淀在了第二层 ( Percoll12% 26% ) 。这个不同之处可能是因为沉淀系数不同以 及成年大鼠和新生大鼠线粒体中细胞成分的密度不 同所 致。调 整 中 层 Percoll 的 浓 度, 调 为 20% 24% , 结果发现在第三层中的线粒体增多 , 而这一层 含有除线粒体以外的其他细胞成分。本实验显示成 年大鼠和新生 大鼠脑组织中的线粒体 有明显的不 同。 从新生大鼠脑组织中分离出的线粒体在电子显
作者简介 : 刘彤 ( 1988- ) , 男 , 吉 林大 学白 求恩 医学 院 07 级
图 2 线粒体超微结 构
临床医学 。 参考文献 :
[ 1] Cassarino DS, Bennett JP. An evaluation of the role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondrial mutat ions and oxidative pathol ogy, prot ective nuclear responses, and cell deat h in neurodegenerat ion, Brain Res[ J] . Brain Res Rev, 1999, ( 29) : 1. [ 2] Kibertis PA. Mitochondrial makes a comeback [ J ] . Science, 1999, 283: 1475. [ 3] Truscott KN, Fanner NP. Import of carrier proteins into mitochondria[ J ] . Biol Chem, 1999, 380: 1151. [ 4] Sims NR, Anderson MF. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient cent rifugation[ J] . Nat Prot oc, 2008, 3( 7) : 1228. [ 5] Dunkley PR, Jarvie PE, Robinson PJ. A rapid Percoll gradient procedure for preparat ion of synapt osomes[ J] . Nat Protoc, 2008, 3( 11) : 1718.
Percoll 浓度在 20% - 24% 时, 观察发现约有 90% 为 线粒体。
图1
不同浓度 Percoll 的线粒体分离图
微镜下观察发现其大小和形状并不相同。绝大多数 的线 粒体很小 ( 0. 5- 1 微米 ) , 形状有 椭圆形和球 形。此形态与成年大鼠脑组织中的线粒体的表现一 致。但一些线粒体被破坏了 , 能够看见其形态但是 缺乏线粒体嵴。如果在脑组织搅拌过程中减少搅拌 次数可以降低线粒体的破坏率, 但是细胞破裂不完 全使细胞沉淀在第二层。 综上所述 , 这些结果显示使用 Percoll 密度梯度 离心的方法可以成功地从新生大鼠脑组织中分离出 线粒体, 为新生大鼠脑组织中线粒体功能研究提供 一个实用的模型。
1006
文章编号 : 1007- 4287( 2011) 06- 1006- 02
Chin J Lab Diagn, June, 2011, Vol 15, No. 6
新生大鼠脑组织中线粒体的分离
刘 彤 1, 李 哲1 , 毕晓颖2*
( 1. 吉林大学白求恩医学院 Baidu Nhomakorabea胞生物学教研室 , 吉林 长春 130021; 2. 吉林大学公共卫生学院 卫生毒理学教研室 )
( 收稿日期 : 2010- 05- 24)
[ 1]
( 4) 将离心管超速离心 19 000 转 5 分钟, 弃去 上清 , 取中层液体并将其 1 4 稀释在线粒体缓冲液 中 , 再超速离心 14 000 转 10 分钟 , 将沉淀稀释在 1 ml 线粒体缓冲液中, 超速离心 14 000 转 5 分钟, 最 后将沉淀溶于 100 微升线粒体缓冲液中。 1. 3. 2 线粒体的电镜观察 ( 1) 将管中一二三层的液体都固定在 2. 5% 的 戊二醛中 , 每个样品用 0. 1 M 的磷酸盐缓冲液 ( 150 mM 磷酸氢二钠 , 100mM 氢氧化钠, PH7. 4) 洗三次共 十分钟 , 然后在 2% 四氧化锇中固定 1 小时。 ( 2) 每个样品再用 0. 1M 的磷酸盐缓冲液洗三 次 , 在浓度分别为 25% 、 50% 、 85% 、 95% 、 100% 的乙 醇溶液中脱水十分钟。 ( 3) 每个样品再在丙烯氧化物中深度脱水十分 钟 , 然后在 1 1 的丙烯氧化物和树脂混和物中渗透 两小时 , 然后在 1: 2 的丙烯氧化物和树脂混和物中 过夜。 ( 4) 最后将样品包埋 入树脂中 70 观察线粒体。 2 结果 2. 1 线粒体的分离 Percoll 密度梯度离心提供获得高纯度脑组织线 过 夜, 电镜
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讨论
线粒体是许多重金属毒作用的靶细胞器, 研究 线粒体功能的改变对于探讨重金属对神经系统的损 伤作用机制具有重要的意义。许多研究者已经报道 了从成人脑组织分离线粒体的不同方法, 但是对新 生儿脑组织中的线粒体分离方法却描述甚少。 最初 , 我们曾用 Ficoll 梯度来分离线粒体, 线粒 体纯度较低, 后来 , 我们改用 Percoll 密度梯度 离心 法从新生脑组织中分离线粒体 , 结果获得了高纯度 和产率的线粒体。本实验从新生大鼠脑组织中分离 线粒体, 并对其特性做出了详尽的分析和阐述。 使
线粒体是细胞的重要细胞器 , 它在细胞能量代 谢、 自由基生成、 蛋白质磷酸化 , 尤其是在细胞凋亡 过程中起核心调控作用 。Science 于 1999 年发表 了 Mitochondrial make a comeback 专题系列论文[ 2] , 重申线粒体再度成为当今生命科学和分子医学中的 热点和前沿。线粒体功能缺陷 可引起神经肌 肉疾 病、 心血管病、 糖尿病、 帕金森氏病和肿瘤学等多种 疾病, 分离线粒体对于我们理解线粒体功能障碍与 相关疾病的机制有重要作用。但是 , 针对新生大鼠 脑组织中线粒体的分离和特性 分析的描述还 不全 面。因此 , 本实验的目的就是建立一个方法, 用来快 速的对新生大鼠脑组织中的线粒体进行分离, 并为 其特性分析奠定基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 新生大鼠 6只、 超速离心机、电子显微 镜、天平、 动物手术器械、 匀浆器 1. 2 试剂 0. 25M 蔗糖、 0. 5 mM K+ EDTA 、10 mM Tris HCl、 10 mg/ ml 牛的血清白蛋白、 用线粒体缓冲液 稀释的浓度分别为 12% 、 26% 、 40% 的 Percoll、 2 5% 戊 二醛、 2% 四氧化锇、 乙醇、 丙烯氧化物、 树脂。 1. 3 方法 1. 3 . 1 线粒体的分离 ( 1) 迅 速摘 取 新生 大鼠 的脑 , 称 重 400 - 500 mg, 移入冰冷的 线粒体分 离缓冲液 ( 0. 25 M 蔗糖 , 0 5 mM K+ EDTA 10mM Tris HCl, pH= 7. 4) 中 , 在实 验过程中所有的仪器和缓冲液都要保持冰冷 ( 4 ) , 每个脑都分离出左右半球, 并保证每个样品中都含 有左右脑组织。 ( 2) 每个样品在 3. 6 ml 12% 的 Percoll 中搅匀 , 用直径为 0. 12 mm 的匀浆器搅拌 10 次, 再用直径为 0. 06 mm 的匀浆器搅拌 10 次。 ( 3) 在离 心管中先铺一 层 1. 2 ml 40% 的 Per coll, 再铺一层 1. 2 ml 26% 的 Percoll, 然后取上述搅 拌好的样品 1. 2 ml 铺在最上层。
粒体的最佳方法, Percoll 密度梯度中的三种浓度的 电镜照片见图 1。在此研究中改变 Percoll 密度梯度 条件可影响线立体的分离纯度和产率。中层 Percoll 浓度在 20% - 24% 时, 超速离心后可以看见在中层 ( 26% ) 和底层( 40% ) 之间有一条很浅的带。电子显 微镜下观察这一条带含有除线立体外的其他细胞成 分。在中层使用 26% 的 Percoll 可以去除这一层并 使中层得到产率更高的线粒体。 2. 2 线粒体的电镜观察 分离第二层线粒体超微结构见图 2。利用上述