07生物素-亲和素

生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)： 能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
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概述
生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS） 是70年代末发展起来的一种以生物素和亲合素的特异 结合反应为原理的新型生物反应放大系统。随着各种 生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于分子生物 学各领域之中。
1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力 的特点，建立了标记亲合素和生物素法与桥联亲合 素—生物素技术。
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生 物)
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
光生物素(photobiotin)光敏物质
侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后，变为芳香基硝基 苯，可直接与腺嘌呤氨基结合，形成B-核酸探针，用于DNA或 RNA的标记。
O
NH NH
N3
NH (CH2)3 N (CH2)3 NH C (CH2)4
S
NO2
CH3
目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。
标记蛋白质醛基的活化生物素
酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）
标记蛋白质巯基的活化生物素
3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）
标记核酸的活化生物素
光生物素、BNHS和BHZ 生物素脱氧核苷三磷酸
适合于Ab、酶、中性或偏 碱性Ag、DNA、蛋白的标记
生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由 于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以 及BAS的应用效果造成干扰。
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。
亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
分子量：68 000
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易
溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构：
I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
如何减小空间位阻
长臂活化生物素 （BCNHS）：
生物素和N-羟基丁二酰 亚胺之间添加了两个6-氨 基已糖分子基团，形成连 结臂，生物素与大分子基 团的距离增加，更易发挥 生物素的活性作用。
标记特点： BNHS和BCNGS中的羧基与蛋白质
中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的
BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质
生物素脱氧核苷三磷酸（BioΒιβλιοθήκη BaidudUTP）
作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
BNHS和BHZ
可直接标记核酸，但对碱基配对有影响（影响氢键的形成）
特性：
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是
BAS多级放大作用的物质基础）； BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则
1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化 酶复合物法（ABC法）。
近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目 前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位 素、凝集素、铁蛋白、核酸等。
生物素—亲合素已成为目前广泛用于微量抗原、抗体 定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
一)生物素 二)活化生物素与标记 三)亲和素及链霉亲和素 四)亲和素及链霉亲和素的标记 五)生物素-亲和素系统 六)生物素-亲和素系统的应用
概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的 一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。
功能：可与多种标记物如酶、荧光素、同位素、凝 集素、铁蛋白、核酸等结合。这些生物活性物质在 生物素化后，其活性不会受到显著影响。如抗体分 子经生物素化后，其结合抗原的活性不受影响。同 样多种酶结生物素化，其催化力也保持不变或稍有 降低 。
使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。
主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。
结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
与亲合素结合
与 抗 体 或 酶 结 合
结构特点： 咪唑酮环/四氢噻吩环
结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ 噻吩环
特性：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 （羧基活化的生物素称活化生物素或生物素衍生物）
生物素的特点： 1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于大分 子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物素与亲和素 间的结合； 2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结合。
多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变； 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，
活性降低；
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；