公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法 (2)

公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法
1范围青岛精诚仪器仪表有限公司
本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。

本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。

2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物
GB/T18204.5公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统
3空气中嗜肺军团菌定量检测
3.1原理
采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。

3.2仪器和设备
3.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。

3.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。

3.2.3便携式冷藏箱。

3.2.4冷冻离心机：温度4︒C。

3.2.5恒温水浴锅或金属浴：温度范围50︒C～99︒C。

3.2.6荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。

3.2.7卤素灯：500W。

3.2.8涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。

3.3材料和试剂
3.3.1酵母浸出粉。

3.3.2蒸馏水。

3.3.3EMA固体粉：5mg/管。

3.3.4无核酸酶去离子水。

3.3.5矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。

3.3.6核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。

3.3.7引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；
下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。

3.3.8探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。

3.3.9标准品质粒。

3.3.10荧光定量PCR反应体系。

3.3.11离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。

3.3.12离心管：15mL，50mL。

3.4样品的采集
3.4.1采样吸收液成分：
酵母浸出粉12g
蒸馏水1000mL
3.4.2采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。

3.4.3采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5中9.5.1规定。

3.4.4将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。

3.4.5将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。

3.4.6按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。

3.4.7采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。

3.5样品处理方法与条件
3.5.1样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3.
4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。

3.5.2EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：取1管5mg EMA固体粉（3.3.3），短暂离心后加入0.5mL灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。

颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，每100μl分装于1.5ml棕色离心管（3.3.11）中，-20℃避光保存。

3.5.3EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：取10μlEMA母液(3.5.2)加990μl灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。

颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，置于1.5ml
棕色离心管中。

每1000μl的EMA工作液可处理70份左右样品，EMA工作液现用现配，使用前计算好所需EMA工作液量。

3.5.4样品避光孵育：取0.5mL经过离心浓缩的气溶胶样品（3.5.1）置于1.5mL透明离心管中，铝箔包裹以便避光。

加入13μLEMA工作液（3.5.3），反复颠倒，混合均匀，短暂离心收集管壁液体，4℃避光孵育5min。

3.5.5样品光照活化：去掉包裹离心管的铝箔，将离心管水平放置在碎冰上，调整样品与卤素灯（3.2.7）的距离，使其垂直距离为15cm，光照5min。

光照阶段需混匀样品1次~2次，使光照均匀，防止样品过热。

3.5.6样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。

3.6样品核酸提取
由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。

附录A所列的空气中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。

3.7荧光定量PCR条件与扩增步骤
3.7.1标准品系列制备：将标准品母液（3.3.8）以十倍梯度依次稀释，在107copies/mL～102copies/mL浓度范围内制备十倍梯度稀释的标准品系列。

稀释方式举例如下：取10μL浓度为X×107copies/mL的标准品母液，编号为①，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×106copies/mL，编号为②；取10μL浓度为②的标准品，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×105copies/mL编号为③；以此类推。

3.7.2扩增体系：每次检测包括至少5个连续浓度标准品，每标准品至少进行3个复孔检测。

每次检测包括阳性和空白对照各一个。

样品进行3个复孔检测。

荧光定量PCR扩增体系（25μL）：其中2×RealMasterMix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.25μL，探针(10μmol/L)0.625μL，20×Probe Enhance Solution1.25μL，模板2μL，ddH2O
8.625μL。

3.7.3扩增条件：94℃预变性4min；然后94℃变性20s，60℃退火延伸60s，61s检测荧光信号，进行40个循环。

3.7.4数据处理：标准曲线相关系数R2>0.99，标准曲线斜率在-3~-3.5之间，扩增效率E 在0.9~1.2之间。

根据标准曲线和样品Ct值计算样品核酸中嗜肺军团菌浓度(copies/mL)。

3.8结果报告
3.8.1采气体积换算：按式（1）换算成标准状态下采气体积。

000273P P t T V V t ⨯+⨯
=（1）
式中：V 0—标准状态下的采气体积，单位为立方米（m 3）；
V t —实际采气体积，为采样流量与采样时间乘积，单位为立方米（m 3）；
t —采样点的环境温度，单位为摄氏度（℃）；
T 0—标准状态下的绝对温度，273K ；
P —采样点的大气压，单位为千帕（kPa ）；
P 0—标准状态下的大气压，101kPa 。

3.8.2浓度计算：空气中存活的嗜肺军团菌浓度按式（2）计算。

001.0V C C ⨯=
（2）
式中：C —空气中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每立方米（copies/m3）；
C0—样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）；V0—标准状态下采气体积，单位立方米（m3）。

3.9方法性能
本方法最低检出空气中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。

当采气体积为2m 3时，最低检出空气中嗜肺军团菌浓度为5copies/m 3。

4水样品中嗜肺军团菌定量检测
4.1分离培养法
4.1.1
原理集中空调冷却水、沐浴水、景观水、娱乐用水等水样品经浓缩后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出水样品中嗜肺军团菌浓度。

4.1.2仪器和设备
4.1.2.1CO 2培养箱：5%CO 2，35℃~37℃。

4.1.2.2微生物过滤系统。

4.1.2.3
恒温水浴箱：50℃±5℃。

4.1.2.4生物安全柜。

4.1.2.5光学显微镜。

4.1.2.6平板振荡器、涡旋振荡器。

4.1.2.7具塞采样瓶：容积 500mL。

4.1.3材料和试剂
4.1.3.1硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。

4.1.3.2滤膜：孔径0.22µm。

4.1.3.3酸处理液[c(HCL-KCL)=0.2mol/L]：pH2.2±0.2。

4.1.3.4GVPC琼脂平板。

4.1.3.5BCYE琼脂平板。

4.1.3.6BCYE-CYE琼脂平板(L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板)。

4.1.3.7军团菌分型血清。

4.1.3.8氯化钠溶液[ρ(NaCL)=0.85%]。

4.1.3.9具塞试管。

4.1.3.10灭菌水。

4.1.4样品采集
4.1.4.1将贝具采样瓶（4.1.2.7）用前灭菌。

4.1.4.2每瓶中加入硫代硫酸钠溶液（4.1.3.1）0.3mL~0.5mL。

4.1.4.3采样点按GB/T18204.5中3.
5.3规定。

4.1.4.4无菌操作采集水样500mL。

4.1.4.5采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不应超过15d，尽快及时进行实验室检测。

4.1.5检验步骤
4.1.
5.1样品预处理：水样品如有杂质可静置去除沉淀，将样品通过0.22µm孔径的微生物过滤系统（4.1.2.2）过滤，取下滤膜剪碎置于10mL原样品中，涡旋振荡器（4.1.2.6）充分振荡洗脱，取洗脱液备用。

4.1.
5.2样品酸处理：取1mL预处理后的样品（4.1.5.1）于无菌具塞试管（4.1.3.9）中，加入适量酸处理液（4.1.3.3），使样品pH值至2.0~2.2，轻轻摇匀，处理时间5min~10min。

4.1.
5.3样品接种：取酸处理的样品0.2mL，划线接种GVPC平板（4.1.3.4），使培养后应形成单个菌落。

4.1.
5.4样品培养：将接种平板静置于5%CO2培养箱（4.1.2.1）中，温度35℃~37℃，孵育3d~10d。

4.1.
5.5菌落观察：军团菌生长缓慢，易被其他菌掩盖，从孵育第3d 开始每天在显微镜上观察。

48h 内生长的菌落非军团菌，48~72h 长出的为可疑军团菌，72h 后生长出的菌落进行计数并继续进行观察。

军团菌菌落通常呈白色、灰色、蓝色或紫色。

菌落整齐，表面湿润，典型菌落呈毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。

4.1.
5.6菌落鉴定：孵育72h 后，从GVPC 平板上用接种环挑取可疑菌落，接种BCYE 平板（4.1.3.5）和BCYE-CYS 平板（4.1.3.6）。

35℃~37℃培养2d ，凡在BCYE 琼脂平板上生长而在BCYE-CYE 琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。

4.1.
5.7嗜肺军团菌鉴定：经血清学凝集实验确定嗜肺军团菌。

在洁净玻片（可用灭菌平板替代）上滴加两滴彼此分离的氯化钠溶液（4.1.3.9）约15μL ，挑取适量待检菌落分别加在两滴氯化钠溶液上，混匀。

其中一滴上加入15μL LP1型诊断血清（4.1.3.8），另外一滴加入15μL 氯化钠溶液作为阴性对照，分别混匀玻片上的两种混合液。

轻轻摇动玻片40s ，观察。

于40s 内呈明显凝集者为LP1型嗜肺军团菌，呈均匀浑浊者为非LP1型嗜肺军团菌。

重复上述实验过程，分别进行LP2~LP15单价或多价血清凝集实验。

4.1.6结果报告
水样品中嗜肺军团菌浓度按式（3）计算。

100021⨯⨯⨯⨯=
ηV V D n C （3）
式中：C —水样品中嗜肺军团菌浓度，单位为菌落形成单位每升（CFU/L ）；
n —每个平板上嗜肺军团菌平均菌落数，单位为菌落形成单位每皿CFUu/皿）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中为10；
V 1—水样品采集量，单位为毫升（mL ）；
V 2—平板接种量，单位为毫升每皿（mL/皿），本方法中为0.2mL/皿；
η—水样品平均加标回收率，本方法为0.9。

4.1.7方法性能
当水样品体积为500mL 时，最低检出嗜肺军团菌浓度为5CFU/mL 。

当水样品中嗜肺军团菌浓度为50cfu/mL 和500CFU/mL 时，加标回收率为80%～100%。

4.2
EMA+qPCR 法4.2.1原理
采用叠氮溴乙锭（EMA ）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测集中空调冷却水、洗浴水、景观水、娱乐水等水样品中存活的嗜肺军团菌。

4.2.2仪器和设备
4.2.2.1冷冻离心机：温度4︒C 。

4.2.2.2
恒温水浴锅或金属浴：温度范围50︒C ～99︒C 。

4.2.2.3荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C 温度范围。

4.2.2.4卤素灯：500W。

4.2.2.5涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。

4.2.2.6微生物过滤系统。

4.2.2.7具塞采样瓶：容积>500mL。

4.2.3材料和试剂
4.2.3.1硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。

4.2.3.2滤膜：孔径0.22µm。

4.2.3.3EMA固体粉：5mg/管。

4.2.3.4无核酸酶去离子水。

4.2.3.5核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。

4.2.3.6引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；
下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。

4.2.3.7探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。

4.2.3.8标准品质粒。

4.2.3.9荧光定量PCR反应体系。

4.2.3.10EP管。

4.2.3.11离心管。

4.2.4样品的采集
水样品采集见4.1.4。

4.2.5样品处理方法与条件
4.2.
5.1样品的过滤浓缩：见4.1.5.1。

4.2.
5.2样品的离心浓缩：取5mL洗脱液（4.2.5.1）于15mL离心管，室温下6000×g离心15min，小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的EP管中，再次室温下6000×g离心15min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。

4.2.
5.3EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：见3.5.2。

4.2.
5.4EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：见3.5.3。

4.2.
5.5样品避光孵育：见3.5.4。

4.2.
5.6样品光照活化：见3.5.5。

4.2.
5.7样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。

4.2.6样品核酸提取
由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。

附录B 所列的水样品中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。

4.2.7荧光定量PCR 条件与扩增步骤
见3.7。

4.2.8结果报告
水样品中存活的嗜肺军团菌浓度按式（4）计算。

10001.0⨯⨯⨯=
V D n C （4）
式中：C —水样品中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每升（copies/L ）；
n —样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中为2；
V —水样品采集体积，单位为毫升（mL ）。

4.2.9方法性能
本方法最低检出水样品中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。

当水样品采集体积为500mL 时，最低检出水样品中嗜肺军团菌浓度为50copies/L 。

5土类样品中嗜肺军团菌定量检测
5.1
原理集中空调风管积尘、花卉土、景观土等土类样品经振荡洗脱后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出土样品中嗜肺军团菌浓度。

5.2仪器和设备
见4.1.2。

5.3材料和试剂
见4.1.3。

5.4样品采集
5.4.1样本采集原则：遵循无菌操作原则采集土类样品，样品采集、储存所使用的器材均经灭菌；土类样品去除砖石瓦块、枝叶秸秆等块状物，风管积尘避免采集风管及过滤网上的絮状纤维杂物。

5.4.2景观土、花卉土等采样：取土样时选取1m 2按5点采样方法，去除1cm 左右的土壤表层后，挖取土样；花卉土等去除表面落叶杂物后，在花卉的周围均匀采取土样，土样量不少于20g/份置于灭菌采样容器中。

5.4.3空调风管积尘采样：根据风管积尘量确定采样面积，积尘量多时可选用5点采样方法，积尘量少则可将一定面积内的风管积尘全部收集，积尘样品量不少于1.5g/份。

5.4.4
样品保存：采集的样品在6℃±2℃、避光的条件下保存，2d 内送实验室检验。

5.5检验步骤
5.5.1样品预处理：采集的样品（5.4.4）充分混匀后无菌操作称取0.5g 空调风管积尘样品或5g 花卉土、景观土样品，风管积尘样品加入4.5mL 0.01%PBS-Tween80洗脱液，花卉土、景观土样品加入45mL 0.01%PBS-Tween80洗脱液，200-250r/min 振荡20～30min ，室温静置≥20min 至上层液体澄清，取上清液备用。

5.5.2
样品酸处理：见4.1.5.2。

5.5.3
样品接种：见4.1.5.3。

5.5.4
样品培养：见4.1.5.4。

5.5.5
菌落观察：见4.1.5.5。

5.5.6
菌落鉴定：见4.1.5.6。

5.5.7
嗜肺军团菌鉴定：见4.1.5.7。

5.6结果报告
土类样品中嗜肺军团菌浓度按式（5）计算。

γ⨯⨯⨯=
21G G D n C （5）
式中：C —土类样品中嗜肺军团菌浓度，单位为菌落形成单位每克（CFU/g ）；
n —每个平板上嗜肺军团菌平均菌落数，单位为菌落形成单位每皿（CFU/皿）；
D —洗脱稀释倍数，本方法中风管积尘为5，其他为50；
G 1—土类样品采集量，单位为克（g ），本方法中风管积尘为0.5g ，其他为5g ；
G 2—平板接种量，单位为毫升每皿（mL/皿），本方法中为0.2mL/皿；
γ—土类样品平均加标回收率，本方法为0.5。

5.7方法性能
最低检出土类样品中嗜肺军团菌浓度为102CFU/g 。

当土类样品中嗜肺军团菌浓度为103cfu/g 时，加标回收率为30%～90%。

A A
附录A
（资料性附录）
空气中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤
注：本附录为空气中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤的一个实例。

A.1材料和试剂
A.1.1OMEGA公司E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit核酸提取试剂盒。

A.1.2TE Buffer。

A.1.3无水乙醇
A.2操作步骤
A.2.1实验前的准备：溶菌酶存储液{ =50mg/mL}保存于-20℃并在使用前解冻，Elution Buffer使用前预热到65℃，无水乙醇稀释DNA Wash Buffer浓缩液。

A.2.2取0.5mL经过EMA处理后的气溶胶样品（3.5.6）8000×g离心20min，弃去上清。

加入180μL的TE Buffer（A.1.2）重悬样品，加入20μL溶菌酶存储液（A.2.1）30℃水浴30min。

A.2.3室温条件下5000×g离心5min，沉淀消化后的细菌，弃去上清，加入200μL的buffer BTL涡旋以悬浮细菌。

A.2.4加25mg~40mg的玻璃珠，室温条件下高速涡旋5min。

静置让玻璃珠沉淀下来，小心吸取上清致一新的灭菌1.5mL离心管中。

A.2.5加入25μL的蛋白酶K并涡旋均匀，将混合均匀的液体放入55℃流动水浴中1h左右，完全溶解细菌。

如果没有流动水浴，可孵育在55℃的水浴锅中，每隔20-30min短暂涡旋离心管。

A.2.6加入5μL的RNA酶A并反复颠倒混匀，在室温条件下孵育30min。

A.2.7室温10000×g离心5min，沉淀不溶解的物质，小心地吸取上清到新的1.5mL离心管中，避免吸到有不溶解的沉淀。

A.2.8加入220μL的Buffer BDL，短暂涡旋混匀，65℃孵育10min。

在加入Buffer BDL后，可能会有絮状沉淀出现，并不影响DNA的复性。

A.2.9加入220μL的无水乙醇，高速涡旋20s，有沉淀出现，用枪头反复吹打以破碎沉淀。

A.2.10将所得到的所有液体转至DNA结合柱內，其中包括在步骤A.2.9过程中形成的沉淀，室温10000×g离心1min，丢弃收集管和其中的滤出液。

A.2.11将柱子装入一个新的收集管，加入500μL的Buffer HB，室温10000×g离心1min，丢弃收集管中的滤出液。

A.2.12将柱子装回刚才收集管，加入700μL无水乙醇稀释后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室温10000×g离心1min，丢弃收集管中的滤出液。

A.2.13再次加入700μL无水乙醇稀释后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室温10000×g离心1 min，丢弃收集管中的滤出液。

A.2.14将柱子装回刚才的收集管中，高速（≥10000×g）离心2min以干燥DNA结合柱，丢弃收集管和滤出液。

A.2.15将柱子置于灭菌的1.5mL离心管上，向DNA结合柱的膜中央加入50μL经65℃预热的Elution Buffer，65℃孵育15min。

A.2.16室温10000×g离心1min，将DNA从柱子上洗脱下来。

A.2.17向DNA结合柱的膜中央再次加入50μL经65℃预热的Elution Buffer，65℃孵育15m in。

A.2.18室温10000×g离心1min，将基因组DNA从柱子上洗脱下来。

A.2.19总共获得100μlLDNA溶液，-20℃保存。

B B
附录B
（资料性附录）
水样品种嗜肺军团菌核酸提取操作步骤
注：本附录为水样品中嗜肺军团菌样品核酸提取操作步骤的一个实例。

B.1材料和试剂
B.1.1OMEGA公司E.Z.N.A.Water DNA Kit核酸提取试剂盒。

B.1.2无水乙醇。

B.2操作步骤
B.2.1实验前准备：DNA Wash Buffer浓缩液按要求添加无水乙醇稀释，Elution Buffer置于65℃预热。

B.2.2取0.5mL经过EMA处理后的水样品（4.2.5.7），转移到15mL离心管中8000×g离心20 min，弃上清保留沉淀。

B.2.3加3mL SLX Buffer、500mg glass beads于上述离心管中，以涡旋机最高速度涡旋3min，或直至样品完全混匀。

B.2.4在70℃水浴锅孵育10min，孵育过程中涡旋样品离心管2-3次。

B.2.5加1mL SP2Buffer，涡旋30s，冰浴30min。

B.2.6在4℃下4000×g离心10min。

B.2.7转移上清液于15mL离心管，加0.7体积异丙醇，翻转倒置30次～50次，-20℃孵育1h.。

B.2.8在4℃下4000×g离心20min沉淀DNA，轻轻的吸取弃去上清，不要碰触下层沉淀DN A。

B.2.9加400μL Elution Buffer，涡旋20s，65℃孵育30min溶解DNA。

B.2.10转移样品到新的1.5mL灭菌离心管中，加100μL HTR Reagent，涡旋10s，室温孵育2min。

注意：HTR Reagent用之前，先涡旋混匀。

B.2.11室温14000×g离心3min，吸取上清液(约400μL)于另一个1.5mL离心管中，如果样品呈现暗色重复B.2.10和B.2.11步骤。

B.2.12向上清液中加入等体积的Buffer XP1，涡旋混匀。

B.2.13将DNA结合柱套入收集管中，全部样品转移到DNA结合柱中，室温10000×g离心1 min，弃去离心液，重复使用收集管。

B.2.14加300μL Buffer XP1到DNA结合柱中，10000×g室温离心1min，丢弃离心液和收集管。

B.2.15将DNA结合柱套入新的收集管中，加750μL DNA Wash Buffer（已用乙醇稀释），室温10000×g室温离心30s，弃去离心液，重复使用收集管。

B.2.16将DNA结合柱放回收集管，≥14000×g离心2min，以干燥DNA结合柱。

弃去收集管。

B.2.17将DNA结合柱套入到新的1.5mL灭菌EP管中，加100μL Elution Buffer于柱子的膜中央，65℃孵育3min。

B.2.18室温14000×g离心1min，弃去结合柱，100μLDNA溶液，-20℃保存DNA备用。