公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法 (2)

公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法1范围青岛精诚仪器仪表有限公司本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。

本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。

2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

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GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB/T18204.5公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统3空气中嗜肺军团菌定量检测3.1原理采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。

3.2仪器和设备3.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。

3.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。

3.2.3便携式冷藏箱。

3.2.4冷冻离心机：温度4︒C。

3.2.5恒温水浴锅或金属浴：温度范围50︒C～99︒C。

3.2.6荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。

3.2.7卤素灯：500W。

3.2.8涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。

3.3材料和试剂3.3.1酵母浸出粉。

3.3.2蒸馏水。

3.3.3EMA固体粉：5mg/管。

3.3.4无核酸酶去离子水。

3.3.5矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。

3.3.6核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。

3.3.7引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。

3.3.8探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。

3.3.9标准品质粒。

3.3.10荧光定量PCR反应体系。

3.3.11离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。

3.3.12离心管：15mL，50mL。

3.4样品的采集3.4.1采样吸收液成分：酵母浸出粉12g蒸馏水1000mL3.4.2采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。

3.4.3采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5中9.5.1规定。

3.4.4将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。

3.4.5将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。

3.4.6按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。

3.4.7采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。

3.5样品处理方法与条件3.5.1样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3.4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。

3.5.2EMA母液{ρ[C21H18BrN5]=10mg/mL}的制备：取1管5mg EMA固体粉（3.3.3），短暂离心后加入0.5mL灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。

颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，每100μl分装于1.5ml棕色离心管（3.3.11）中，-20℃避光保存。

3.5.3EMA工作液{ρ[C21H18BrN5]=100μg/mL}的制备：取10μlEMA母液(3.5.2)加990μl灭菌无核酸酶去离子水（3.3.4）。

颠倒混匀，短暂离心收集管壁液体，置于1.5ml棕色离心管中。

每1000μl的EMA工作液可处理70份左右样品，EMA工作液现用现配，使用前计算好所需EMA工作液量。

3.5.4样品避光孵育：取0.5mL经过离心浓缩的气溶胶样品（3.5.1）置于1.5mL透明离心管中，铝箔包裹以便避光。

加入13μLEMA工作液（3.5.3），反复颠倒，混合均匀，短暂离心收集管壁液体，4℃避光孵育5min。

3.5.5样品光照活化：去掉包裹离心管的铝箔，将离心管水平放置在碎冰上，调整样品与卤素灯（3.2.7）的距离，使其垂直距离为15cm，光照5min。

光照阶段需混匀样品1次~2次，使光照均匀，防止样品过热。

3.5.6样品存放：光照结束后，4℃保存样品，24h内提取核酸。

3.6样品核酸提取由于样品核酸提取的条件与操作步骤因使用试剂盒的不同而有差异，所以应根据所使用的核酸提取试剂盒的操作手册进行操作。

附录A所列的空气中嗜肺军团菌核酸提取操作步骤是一个实例。

3.7荧光定量PCR条件与扩增步骤3.7.1标准品系列制备：将标准品母液（3.3.8）以十倍梯度依次稀释，在107copies/mL～102copies/mL浓度范围内制备十倍梯度稀释的标准品系列。

稀释方式举例如下：取10μL浓度为X×107copies/mL的标准品母液，编号为①，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×106copies/mL，编号为②；取10μL浓度为②的标准品，加入90μL无核酸酶去离子水轻柔混匀，浓度为X×105copies/mL编号为③；以此类推。

3.7.2扩增体系：每次检测包括至少5个连续浓度标准品，每标准品至少进行3个复孔检测。

每次检测包括阳性和空白对照各一个。

样品进行3个复孔检测。

荧光定量PCR扩增体系（25μL）：其中2×RealMasterMix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1.25μL，探针(10μmol/L)0.625μL，20×Probe Enhance Solution1.25μL，模板2μL，ddH2O8.625μL。

3.7.3扩增条件：94℃预变性4min；然后94℃变性20s，60℃退火延伸60s，61s检测荧光信号，进行40个循环。

3.7.4数据处理：标准曲线相关系数R2>0.99，标准曲线斜率在-3~-3.5之间，扩增效率E 在0.9~1.2之间。

根据标准曲线和样品Ct值计算样品核酸中嗜肺军团菌浓度(copies/mL)。

3.8结果报告3.8.1采气体积换算：按式（1）换算成标准状态下采气体积。

000273P P t T V V t ⨯+⨯=（1）式中：V 0—标准状态下的采气体积，单位为立方米（m 3）；V t —实际采气体积，为采样流量与采样时间乘积，单位为立方米（m 3）；t —采样点的环境温度，单位为摄氏度（℃）；T 0—标准状态下的绝对温度，273K ；P —采样点的大气压，单位为千帕（kPa ）；P 0—标准状态下的大气压，101kPa 。

3.8.2浓度计算：空气中存活的嗜肺军团菌浓度按式（2）计算。

001.0V C C ⨯=（2）式中：C —空气中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每立方米（copies/m3）；C0—样品核酸中嗜肺军团菌浓度，单位为拷贝数每毫升核酸（copies/mL ）；V0—标准状态下采气体积，单位立方米（m3）。

3.9方法性能本方法最低检出空气中嗜肺军团菌核酸浓度为102copies/mL 。

当采气体积为2m 3时，最低检出空气中嗜肺军团菌浓度为5copies/m 3。

4水样品中嗜肺军团菌定量检测4.1分离培养法4.1.1原理集中空调冷却水、沐浴水、景观水、娱乐用水等水样品经浓缩后，接种于GVPC 琼脂平板生成单个军团菌菌落，并在BCYE 琼脂平板上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE 琼脂平板上不生长，进一步经血清学实验鉴定确认为嗜肺军团菌，依照样品量、加标回收率等定量计算得出水样品中嗜肺军团菌浓度。

4.1.2仪器和设备4.1.2.1CO 2培养箱：5%CO 2，35℃~37℃。

4.1.2.2微生物过滤系统。

4.1.2.3恒温水浴箱：50℃±5℃。

4.1.2.4生物安全柜。

4.1.2.5光学显微镜。

4.1.2.6平板振荡器、涡旋振荡器。

4.1.2.7具塞采样瓶：容积 500mL。

4.1.3材料和试剂4.1.3.1硫代硫酸钠溶液[c(Na2S2O3)=0.1mol/L]。

4.1.3.2滤膜：孔径0.22µm。

4.1.3.3酸处理液[c(HCL-KCL)=0.2mol/L]：pH2.2±0.2。

4.1.3.4GVPC琼脂平板。

4.1.3.5BCYE琼脂平板。

4.1.3.6BCYE-CYE琼脂平板(L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板)。

4.1.3.7军团菌分型血清。

4.1.3.8氯化钠溶液[ρ(NaCL)=0.85%]。

4.1.3.9具塞试管。

4.1.3.10灭菌水。

4.1.4样品采集4.1.4.1将贝具采样瓶（4.1.2.7）用前灭菌。

4.1.4.2每瓶中加入硫代硫酸钠溶液（4.1.3.1）0.3mL~0.5mL。

4.1.4.3采样点按GB/T18204.5中3.5.3规定。

4.1.4.4无菌操作采集水样500mL。

4.1.4.5采集的样品2d内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不应超过15d，尽快及时进行实验室检测。

4.1.5检验步骤4.1.5.1样品预处理：水样品如有杂质可静置去除沉淀，将样品通过0.22µm孔径的微生物过滤系统（4.1.2.2）过滤，取下滤膜剪碎置于10mL原样品中，涡旋振荡器（4.1.2.6）充分振荡洗脱，取洗脱液备用。

4.1.5.2样品酸处理：取1mL预处理后的样品（4.1.5.1）于无菌具塞试管（4.1.3.9）中，加入适量酸处理液（4.1.3.3），使样品pH值至2.0~2.2，轻轻摇匀，处理时间5min~10min。

4.1.5.3样品接种：取酸处理的样品0.2mL，划线接种GVPC平板（4.1.3.4），使培养后应形成单个菌落。

4.1.5.4样品培养：将接种平板静置于5%CO2培养箱（4.1.2.1）中，温度35℃~37℃，孵育3d~10d。