第10章分子杂交技术hu
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• 再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗 涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法 是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因 或顺序。来分析DNA样品之间的同源性。
• 此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要 进一步做Southern blotting加以验证。
1.3 Southern blotting
1.6 电镜观察
• 先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内 含子的探测以及缺失的确定等。
• 断裂基因就是用这种方法发现的。
• 电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mapping），二是R-环定位法（R-loop mapping）
• 将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜 下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。
①1961年，Hall等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的 研究。
②1962年，Bolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称 为DNA-琼脂技术。
✓ 变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互 补核酸序列杂交。
✓ 用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜， 然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。
• 如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。
②膜上分子杂交
• 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤 维膜），这种膜只吸附单链DNA。
• 将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死 细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；
• 然后用无关的单链DNA，如常用小牛胸腺DNA和 鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交， 防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。
• 该技术是Southern，E.M于1975年首先建立的， 故称为Southern杂交，该方法经Southern印迹法 将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNA探 针杂交。
• 用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性 片段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blot） （用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行 Southern blotting）等。
• 首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用 含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用 是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰 实验结果。
• 电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液 相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基 因表达的时空特异性。
1.5 Western blotting
• 既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随 之而来的就是“西方”杂交（Western blotting）， 但Western blotting和前面的几种杂交都不相同， 它是用来测蛋白而不是检测核酸。
• 此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的 蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反 应或结合反应测定蛋白质技术。
➢ 从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等） 内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt） 的片段。剪切的DNA液，经煮沸使dsDNA热变性 成ssDNA。然后冷至约60℃，在此温度孵育过程 中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度 （减色效应）来监测互补链的复性程度。
➢ 该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并 可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。
➢ 通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因 数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它 特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是 现代膜杂交实验的基础。
④上世纪60年代末，Britten等设计了另一种分析细 胞基因组的方法。研究液相中DNA的复性以比较 不同来源核酸的复杂度，
1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） ①玻片原位杂交
• 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等;
• 片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性， 然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充 分洗脱；
• 若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或 复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然 后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的 相对位置。
• R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行 杂交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的 双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换 了出来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。
第二节 核酸杂交简史与原理
2.1 核酸杂交技术简史 2.2 核酸杂交原理
2.1 核酸杂交技术简史
✓ 在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性 与结合的探针量呈正比。
③ 上世纪60年代中期，Nygaard 等的研究为应用标记DNA 或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序 列奠定了基础。
➢ 如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。 RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下 与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化 非特异性结合的RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。
• 膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中 缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。
1.2 斑点杂交（dot blotting）
• 也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方 法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上， 或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后 将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。
1.4 Northern hybridization
• Northern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓 “Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己 的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。
• Northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验 RNA，而不是DNA。
• 此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要 进一步做Southern blotting加以验证。
1.3 Southern blotting
1.6 电镜观察
• 先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内 含子的探测以及缺失的确定等。
• 断裂基因就是用这种方法发现的。
• 电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mapping），二是R-环定位法（R-loop mapping）
• 将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜 下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。
①1961年，Hall等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的 研究。
②1962年，Bolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称 为DNA-琼脂技术。
✓ 变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互 补核酸序列杂交。
✓ 用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜， 然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。
• 如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。
②膜上分子杂交
• 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤 维膜），这种膜只吸附单链DNA。
• 将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死 细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上；
• 然后用无关的单链DNA，如常用小牛胸腺DNA和 鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交， 防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。
• 该技术是Southern，E.M于1975年首先建立的， 故称为Southern杂交，该方法经Southern印迹法 将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNA探 针杂交。
• 用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性 片段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blot） （用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行 Southern blotting）等。
• 首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然后用 含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用 是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰 实验结果。
• 电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液 相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基 因表达的时空特异性。
1.5 Western blotting
• 既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随 之而来的就是“西方”杂交（Western blotting）， 但Western blotting和前面的几种杂交都不相同， 它是用来测蛋白而不是检测核酸。
• 此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的 蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反 应或结合反应测定蛋白质技术。
➢ 从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等） 内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt） 的片段。剪切的DNA液，经煮沸使dsDNA热变性 成ssDNA。然后冷至约60℃，在此温度孵育过程 中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度 （减色效应）来监测互补链的复性程度。
➢ 该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并 可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。
➢ 通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因 数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它 特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是 现代膜杂交实验的基础。
④上世纪60年代末，Britten等设计了另一种分析细 胞基因组的方法。研究液相中DNA的复性以比较 不同来源核酸的复杂度，
1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） ①玻片原位杂交
• 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等;
• 片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性， 然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充 分洗脱；
• 若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或 复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然 后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的 相对位置。
• R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DNA进行 杂交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的 双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换 了出来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。
第二节 核酸杂交简史与原理
2.1 核酸杂交技术简史 2.2 核酸杂交原理
2.1 核酸杂交技术简史
✓ 在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性 与结合的探针量呈正比。
③ 上世纪60年代中期，Nygaard 等的研究为应用标记DNA 或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序 列奠定了基础。
➢ 如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。 RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下 与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化 非特异性结合的RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。
• 膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中 缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。
1.2 斑点杂交（dot blotting）
• 也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方 法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上， 或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后 将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。
1.4 Northern hybridization
• Northern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓 “Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己 的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。
• Northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验 RNA，而不是DNA。