抑肽酶对血小板PAR1活化保护机理的探究

抑肽酶对血小板ＰＡＲｌ活化保护机理的研究

摘要

目的：抑肽酶是一种从牛肺组织提取的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，因为其具有减少出血和输血的作用，已经被广泛地应用于体外循环和各种复杂的外科手术中。现在已经知道抑肽酶对纤维蛋白溶解系统存在一些生化作用，但是它对血小板的保护机理尚不明了。凝血酶是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，是参与凝血过程各个环节反应的关键酶。血小板膜上主要的凝血酶受体——蛋白酶激活受体－１（ＰＡＲｌ），需要经过凝血酶的蛋白水解激活才能产生血小板活化反应的细胞内信号传递。本实验通过人洗涤血小板体外模型，比较抑肽酶对不同类型致聚剂诱导的血小板活化反应的不同影响，旨在观察抑肽酶保护血小板的效果，并探讨其可能的作用机制。

材料和方法：２５～４５岁的健康男性献血员，采血前两周内未服用任何药物，随机分为三组：生理盐水对照组（ＯⅪＵ／ｍｌ，Ａｏ）、小剂量抑肽酶组（１００ＫＩＵ／ｍｌ，Ａ１）、大剂量抑肽酶组（３００ⅪＵ／ｍｌ，Ａ２）。肘静脉取血，ＡＣＤ抗凝（全血：ＡＣＤ＝９：ｌ，ｖ／ｖ），以离心法制成２×１０８／ｍｌ的洗涤血小板悬液。流式细胞术检测血小板膜上凝血酶受体ＰＡＲｌ的表达。以比浊法测量蛋白水解酶类致聚剂（凝血酶）和非蛋白水解酶类致聚剂（ＡＤＰ、ＰＭＡ、肾上腺素、ＳＦＬＬＲＮ、胶原）诱导的血小板聚集反应，计算抑肽酶对血小板聚集的抑制率。以双波长荧光比值法测量蛋白水解酶类致聚剂（凝血酶）和非蛋白水解酶类致聚剂（肾上腺素、ＳＦＬＬＲＮ）诱导的赢小板内游离Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋］．）的变化，以及抑肽酶对［ｃａ２＋］．变化的影响。以蛋白印迹法观察抑肽酶对凝血酶诱导的血小板内细胞骨架蛋白含量变化的影响。最后，电镜观察抑肽酶对凝血酶诱导的血小板超微结构变化的影响。

结果和结论：实验发现：①流式细胞术检测发现加入一抗的洗涤血小板与未加一抗的洗涤血小板比较其ＰＡＲｌ受体的表达相差非常显著。②凝血酶诱导时，Ａｌ、Ａ２的血小板聚集率较Ａｏ明显低下，组间相差非常显著；且Ａ２对血小板聚集的抑制程度较Ａ。更大，组间相差非常显著。而ＳＦＬＬＲＮ、ＡＤＰ、ＰＭＡ、肾上腺素、胶原诱导时，Ａｌ、Ａ２的血小板聚集率较Ａｏ无显著差异，Ａ２与ＡＩ比较其抑制程度无显著差异。③凝血酶诱导组，胞外Ｃａ２＋浓度为ｌｍＭ时，Ａ１与Ａ＿ｏ比较其静息状态下的［Ｃａ２＋］ｊ无显著差异；Ａ，、Ａｏ激活后的［Ｃａ２＋］ｉ峰值较静息状态时的［ｃａ２＋］ｉ值明显增加，相差非常显著；但是Ａ．激活后的［ｃａ２＋］ｉ峰值比Ａｏ激活后的［Ｃａ２＋］ｉ峰值明显低下，组间相差非常显著。ＳＦＬＬＲＮ和肾上腺素诱导组，胞外ｃａｏ农度为ｌｍＭ时，ＡＩ与～比较其静息状态下的

ＶＩ

［ｃａ”］．无显著差异：Ａｌ、舢激活后的［Ｃａ２＋］ｉ峰值较静息状态时的［ｃ０１ｉ值明显增加，相差非常显著；但是Ａｌ激活后的［ｃａ２＋］ｉ峰值比Ａｏ激活后的［Ｃａ２＋］ｉ峰值无明显变化，组间无显著差异。④在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱上分子量为４３ｋＤａ的区带，Ａｌ、Ａ２和阳性对照较Ａｏ着色要粗深。但Ａ１、Ａ２和阳性对照各组，其４３ｋＤａ的区带着色深浅并无明显差异。⑤电镜观察，Ａ０血小板大小及形态不规则，伪足增多，三五聚集成团，膜破裂水肿，胞内空泡明显增多，胞浆内颗粒物明显减少：Ａｌ血小板形态规则，表面较光滑，伪足少，膜较完整，聚集体少见，胞内空泡少，颗粒物多；Ａ２血小板形态保持正常，无聚集，胞浆内颗粒明显，无明显释放。本研究据此得出以下结论：１．用离心法制备的人洗涤血小板表面仍然有ＰＡＲｌ受体的表达。

２．抑肽酶能竞争性地抑制经队Ｒｌ途径诱导的血小板活化反应，而对由非ＰＡＲｌ途径诱导的血小板活化反应没有抑制作用。抑肽酶对血小板活化反应的抑制作用具有特异性。

３．抑肽酶可能通过抑制蛋白水解酶类致聚剂对ＰＡＲｌ受体的蛋白水解激活，进而抑制栓系配体的暴露、结合及信号一反应偶联，从而最终抑制血小板活化反应。

４．抑肽酶对栓系配体与ＰＡＲＩ受体的结合、信号．反应偶联的下游途径和血小板聚集反应的最后共同阶段没有影响。

５．抑肽酶对与血小板活化反应相关联的细胞骨架蛋白的变化没有抑制作用。

关键词：抑肽酶血小板蛋白酶激活受体一ｉ血小板聚集钙

细胞骨架蛋白超微结构

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第三军医大学硕士研究生论文

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