酶组织化学和组织化学染色

第14章酶组织化学和组织化学染色

酶

酶是由细胞合成的生物催化剂，它们增加整个过程的反应速率，而自身的数量和特性不会改变。

组织化学

组织化学被Pearse定义为“用化学或物理的测试方法对细胞和组织中的特定物质、反应基团和酶催化物质进行鉴定、定位和定量的方法”。因此，采用化学方法技术将组织细胞中的物质进行定位，以用于显微观察的过程就是组织化学技术。

酶组织化学技术

酶组织化学技术是将免疫学和分子生物学相结合的一种组织学技术。组织中酶的表现与其他无活性组织成分完全不同，酶必须是具有活性的。而且，细胞内酶的表达主要取决于酶在活性位点的特定底物和形成不溶物质，这种不溶物质随后变成有色体或不透明体。

组织必须尽可能新鲜才适合酶的表达，尸检组织/尸体解剖通常不适合用于研究。经处理不能被用于酶表达的组织要保存在冰箱中。对于大多数酶来说，它们的表达需要新鲜组织（如细胞培养物）或冷冻/晶体组织和冷冻干燥的组织切片，但是，一些酶如碱性磷酸酶或酸性磷酸酶对底物具有抵抗性，因此它们无法表达。

定影液

冰箱冷却丙酮，并用甲醛盐水或95％乙醇作为缓冲剂，在大多数情况下，冷丙酮用于酶的表达。

酶组织化学原理

组织化学方法是基于生化反应，含有酶的组织或细胞当置于溶液中时，它们与溶液发生化学反应，产生着色的不溶性产物，然后可以在细胞或组织中评估最终产品的位置和数量。

经典组织化学反应

通常遵循以下四个原则之一：

*简单离子相互作用。

*醛与希夫试剂或银化合物的反应。

*芳香族重氮盐与芳香族残基的偶联。

*底物和酶的转化形成着色沉淀。

酶的分类

*氧化还原酶：它是一个大组，由以下亚组组成：

-氧化酶：在氧气存在下催化底物的氧化。

-脱氢酶：通过除去氢原子来催化底物的氧化。

-过氧化物酶：通过除去与过氧化氢结合的氢原子来催化底物氧化。

-Diaphoresis酶：通过除去氢原子来催化NADH和NADPH的氧化。

*水解酶：催化引入水中元素成为特定的底物键。

*转移酶：催化两种化合物基团的转移，但不利用也不损失水分。

*裂解酶：催化从底物中去除基团从而形成碳双键。脱羧酶是该组一个亚类。

组织化学反应类型

主要有四种类型：

1.同时捕获。

2.孵育后偶联（后耦合）。

3.自色底物反应。

4.分子内重排。

同时捕获

是酶表达的最重要技术。

原理

*Gomori金属沉淀技术。

*偶氮染料法。

技术路线

初级反应产物（PRP）：是酶在底物上的反应的产物。

最终反应产物（FRP）：为不溶性无色PRP的产物，其已变为有色的或不透明的产物。

示例：碱性磷酸酶的重氮技术。

本反应的局限：

PRP（初级反应产物）的扩散，这种扩散取决于以下因素：

*PRP和重氮盐的偶联速率。

*底物的水解速率。

*缓冲区PRP的扩散系数。

*缓冲介质和重氮盐的pH值。

后耦合

技术路线

示例：Rutenberg和Seligman酸性磷酸酶技术。

本反应的优势：

*第一次反应可持续较长时间，因为大多数重氮盐在水溶液中分解缓慢。

*酶和重氮盐的最佳pH可以单独使用。

本反应的局限：

*PRP并不是完全不溶性物质。

*PRP存在某些扩散作用。

自色底物反应

技术反应

示例：Burstone碱性磷酸酶荧光技术。

本反应的优势

不需要重氮盐配合物。

技术路线

示例：Nachlas描述的羧酸酯酶技术。

对照部分

酶组织化学中酶活性的表达期间应使用对照部分。它可以通过两种方式进行准备：

*将试验部分在特定底物中温育，将对照部分保存在蒸馏水中，两组进行相同的实验步骤；

*另一个对照部分的获取，可以在沸水中保持15分钟（从而破坏酶）或通过在37℃下M/100氟化钠中温育60分钟来获得。

诊断应用

酶组织化学技术没有广泛应用于手术和尸检的诊断。这是因为：

*当组织常规处理并加工成石蜡时，会发生酶的全部或部分失活。

*需要新鲜的组织材料。

*大多数反应的相对非特异性。

*技术的复杂性。

目前，最常用于诊断的酶组织化学方法是骨骼肌相关酶（用于肌肉相关疾病研究），乙酰胆碱酯酶（用于诊断Hirschsprung氏病）和氯乙酸酯酶（用于表达肥大细胞和骨髓细胞）的组织化学方法。后者被称为莱德氏技术，理论基础为这些细胞中存在的酶酯酶是抵抗福尔马林固化和石蜡包埋作用的少数酸性磷酸酶之一。

这种方法应用于诊断的另一个例子是黑素细胞中的DOPA反应，可以诊断黑素细胞肿瘤。该反应取决于酶酪氨酸酶，需要使用新鲜的组织，该技术的改进版能够在石蜡包埋材料中显现沉淀产物。

在多聚甲醛固定后，塑料包埋技术可以使各种酶的良好形态细节得以保存，即使在超微结构（电子显微镜）下也可以进行酶组织化学实验。

近来，目前酶组织化学在手术组织学中的共同应用是：

*骨骼肌活检。

*在疑似Hirschsprung氏病的情况下快速方便地检测神经节和神经。

*在疑似乳糜泻的空肠活检中证明特异性乳糖酶或蔗糖酶缺乏症。

*论证白细胞的骨髓谱系和肥大细胞（氯乙酸酯酶技术）。

*其他方面（例如前列腺癌中的酸性磷酸酶和血管内皮肿瘤中的碱性磷酸酶）（表1）。

骨骼肌活检

未固定骨骼肌低温恒温器存在于不同类型的肌纤维中，如I型、2A型、2B 型和2C型。它还显示不同纤维的数量、尺寸和相对比例的变化。

常用于肌肉活检的组织化学方法：

*腺苷三磷酸酶（ATPase）。

*NADPH心肌黄酶。

*磷酸。

*细胞色素氧化酶。

腺苷三磷酸酶（ATP酶）

组分：低温恒温器。

试剂

1．0.1M甘氨酸缓冲液：

-甘氨酸：375毫克

-NaCl：292.5mg

用蒸馏水补足50毫升。

2．0.1M甘氨酸缓冲液，0.75M CaCl

2

：

-0.1M甘氨酸缓冲液（溶液1）：25mL

-0.75M CaCl

2

（氯化钙）：5mL

（11.03g CaCl

2·2H

2

O溶解在100mL蒸馏水中）充分混合，加入约11mL的

0.1M NaOH使pH为9.4。

3．0.1M醋酸缓冲液，pH4.2和pH 4.6。

4．孵化溶液：

-ATP：5mg

-溶液2：10mL

根据需要用0.1M NaOH或0.1M HCl调节至pH 9.4。

组织化学方法（pH9.4）

1．在37℃孵育溶液4中孵育未固定的新鲜切割的低温恒温器部分。

2．用蒸馏水冲洗干净。

3．将载玻片浸入2％氯化钴中5分钟。

4．用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗三次。

5．浸入1：10稀释的硫化铵溶液（在通风柜中）30秒钟。

6．用自来水冲洗。

7．在哈里斯苏木精中轻轻复染。

8．用自来水染蓝。

9．分级酒精脱水。