核酸定量

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核酸定量分析

DNA 或 RNA(以260nm处的吸光值为基础)

1. 制备用蒸馏水稀释过的DNA 或 RNA 样品溶液 ( 典型稀释比为 1:100 或 5:500μl)

2. 使用紫外光源,在260 nm 处测定吸光值,也可以在280 nm 和230 nm 测定吸光值 (260/280

的光吸收值比粗略为2/1；260/230的光吸收值比也应接近 2/1)

3. 计算原液浓度:

A260 x 转化系数 x 稀释率 = DNA 原始浓度 (μg/ml)光吸收值单位

双链 DNA 的转化系数是 50μg/ml；单链 DNA 和 RNA 的转化系数是 40μg/ml

平均的脱氧核苷酸(碱基) 分子量是 326.95，因此，平均的碱基对的分子量是753.9。

为便于计算，这个值的单位可以用微摩尔，比如下面的例子:

(2 x μg DNA)+[753.9 x(双链DNA的碱基对数)]

因此，1 μg的 pUC DNA就等于 2 x 1 μg + [753.9 μg/ μmol bp x 2676 bp] 或 2 μg + 2017436.4 μg/ μmol = 1 x 10-6 μ摩尔

寡核苷酸

1. 寡核苷酸的消光系数(∈)的计算:

a. 将碱基A、C、G 和 T 的出现次数用表格统计出来

b. 乘以如下数值:

A的次数 x 15.4 ml/µmole

C的次数 x 7.3 ml/µmole

G的次数 x 11.7 ml/µmole

T的次数 x 8.8 ml/µmole

c. 这些结果的总和就是消失系数，∈

2. 测定寡核苷酸溶液在260nm 的吸光值

3. 用下列公式计算浓度:

浓度 = A260 ÷ ∈ (注: μmol/ml = mM)

NB. 购买的寡核苷酸通常是冰冻干粉的形式，以O.D. 值为计量单位。一个O.D.单位相当于这一个样品在 1 毫升中(初略)重悬浮后的A260值。用上述公式，此数据即可用来估测寡聚核苷酸在这种溶液中的浓度，以这个数据为基础，可以准备更合适的寡聚物的浓度。

例如：

一个寡核苷酸的∈为262.9 ml/µmole，现在有一 3 O.D.的寡核苷酸；因此，1 ml的溶液的浓度可达 262.9 ml/µmole = 11.4μM，那么要获得一 20μM 的溶液，由于 C1V1 = C2V2:

1ml x 11.4 µM = ? x 20 µM；(1ml x 11.4µM)/20µM = 0.570ml.

需将此液在 570 µl 中重悬浮!

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