动物组织块DNA的提取

【实验目的】

（1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。

（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。

【实验原理】

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

【仪器、材料、试剂】

（一）仪器

1．高速离心机

2．烘箱

3．冰箱

4．水浴锅

5．微量移液器

6．高压灭菌锅

（二）材料

1．生理盐水

2．十二烷基硫酸钠（SDS）

3．三羟甲基氨基甲烷（Tris）

4．乙二胺四乙酸（EDTA）

5．饱和酚

6．氯仿

7．异戊醇

8．无水乙醇

9．75%乙醇

10．蛋白酶K

11．RNase酶

12．手术剪刀、镊子、吸水纸

13．微量取液器

14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔

（三）试剂配制

1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml

配制方法：

40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml

配制方法：

在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml

配制方法：

将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES缓冲液（释放DNA）100ml

配制方法：

将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml 的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5．10% SDS（变性剂破细胞壁）100ml

配制方法：

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。

7．RNA酶（降解RNA）

配制方法：

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml

按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保存备用。9．TE缓冲液（溶解DNA）PH8.0 50ml

配制方法：

将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

【实验步骤】

1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。2．加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。

3．放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。

4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。

5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。

6．加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。

7．12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。

8．-20°C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。9．加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20°C保存备用。

【注意事项】

1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。