免疫组织化学染色技术
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免疫组织化学染色技术
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第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平
组织形态学研究技术的种类：
一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如：
通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序
1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体） 孵育切片 发色剂显色 （核复染）
Awenku.baidu.com
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（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣 根 过 氧 化 物 酶 （ horseradish peroxidase ， HRP）
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统 发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质 （抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合 反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠制
备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。
上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的 形态改变。
三、超微结构的观察
• 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。
• 电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。
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第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫 学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白 分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应
的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
A 等之间存在的共同抗原7
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
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一、免疫组织化学染色方法的原理
➢ 脂肪组织染色法
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样
硬化大体标本的染色
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试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 ➢早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS
(pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如：
CN为蓝色
TMB为深蓝色
AEC为红色
DAB为棕色
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碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)
2. 抗体的种类: 五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、 IgM
免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是 IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。
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• 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理
染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种 显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。
以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。
ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的 血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。
由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终 浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性 ALP活性可被抑制。
孵育20 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔
组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
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二、光学显微镜下的组织学染色方法
• 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） • 组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、 细胞DNA和RNA的染色等
通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜
下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在
与否。
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2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理
荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其 中以酶标抗体法应用最为广泛。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与 切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显 示出所检测的目的抗原的部位。
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第一节 常规组织学染色技术概述
宏观 微观 超微结构 基因水平
组织形态学研究技术的种类：
一、病理大体组织标本的染色方法
在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标 本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本 进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不 同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特 点，如：
通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序
1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体） 孵育切片 发色剂显色 （核复染）
Awenku.baidu.com
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（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣 根 过 氧 化 物 酶 （ horseradish peroxidase ， HRP）
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统 发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质 （抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合 反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗原分子与抗
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠制
备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。
上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的 形态改变。
三、超微结构的观察
• 光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2m 有效放大倍数最高不超过2000倍。
• 电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。
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第二节 免疫组织化学染色技术
Immunohistochemical technique
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
大部分抗体电泳后位于区带，1972年国际免疫 学联合会正式将化学结构相同或相似的一类球蛋白 分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。
体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应
的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
A 等之间存在的共同抗原7
该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构 或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫 细胞化学技术。
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为： 1. 免疫酶细胞化学技术 2. 免疫荧光细胞化学技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学技术 5. 免疫电子显微镜技术
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一、免疫组织化学染色方法的原理
➢ 脂肪组织染色法
目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样
硬化大体标本的染色
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试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ 结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 ➢早期心肌梗死染色法 目的：显示早期心肌梗死的区域 试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS
(pH 7.6) 方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
HRP + D + 2H2O
HRP催化的酶促反应第一步是特异的，其余反应是 非特异的，因此，可选用各种供氢体作为显色剂，可使 反应的终产物呈现不同的颜色，如：
CN为蓝色
TMB为深蓝色
AEC为红色
DAB为棕色
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碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)
2. 抗体的种类: 五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、 IgM
免疫组织化学染色技术中，使用的抗体主要是 IgG，个别情况下使用IgG的亚型，多为IgG1。
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• 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理
染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种 显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。
以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸盐）为底物，FB/FR (Fast blue/Fast red)为发色剂，生成蓝色 / 红色不容性沉淀物。
ALP标记的抗体主要用于内源性过氧化物酶含量较高的 血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。
由于组织细胞内含有内源性ALP，在显色液中需加入终 浓度为2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多数内源性 ALP活性可被抑制。
孵育20 min。 结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔
组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。 注意 ：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。
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二、光学显微镜下的组织学染色方法
• 常规HE染色（hematoxylin and eosin staining） • 组织学特殊染色
1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神经纤维的镀银染色 3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、 细胞DNA和RNA的染色等
通过免疫组织化学染色技术，在光学显微镜
下即可检测到所要研究的蛋白分子类物质的存在
与否。
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2. 免疫组织化学染色的显色原理
(1) 基本原理
荧光标记或酶标抗体的染色分为直接法和间接法。其 中以酶标抗体法应用最为广泛。
直接法：是将酶直接标记在第一抗体上，用酶标抗体与 切片上待检测的组织或细胞中抗原反应，再用底物显色，显 示出所检测的目的抗原的部位。