食品应用生物技术实验指导

纤溶酶是大豆发酵过程中由微生物分泌的一种蛋白水解酶，在酶学分类上有些是丝氨酸蛋白酶，有些是金属蛋白酶，具有能直接降解血栓纤维蛋白，并不降解血浆纤维蛋白原，可口服，经消化道直接吸收，安全可靠，在人体内半衰期长，不易引起体内出血等优势，被认为是潜在的、安全的溶栓剂。

一、基本原理

能够产生纤溶酶的菌株在初筛平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

二、实验目的

学习用选择平板分离纤溶酶产生菌的方法，获得产纤溶酶菌株。

三、实验器材

1. 原料

豆豉或纳豆

2. 溶液和试剂

蛋白胨，牛肉膏，琼脂粉，氯化钠，酪蛋白，营养琼脂，葡萄糖等。

3. 仪器和用品

三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，培养摇床，高压灭菌锅，天平、振荡混合器

四、操作步骤

1. 初筛培养基的配制（%）：大豆蛋白胨 1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白

2.0，琼脂粉2.0

2. 菌种保存斜面的配制（%）：葡萄糖0.5，营养琼脂

3.5。分装成若干支试管，试管上带棉塞。（每人3支试管）

3. 培养基与器皿（1.5 mL离心管60个，无菌水100 mL）的灭菌

121℃，灭菌15 min

4. 菌液的制备

分别称取3 g原料于研钵中，加入10 mL无菌水研碎后，转移至无菌离心管中，迷你离心机离心后，将上清液转移至试管中，备用。

5. 菌液的梯度稀释与划线

移取上述菌液0.5 mL至4.5 mL无菌水中，制成10-1菌液，依次类推，制成10-2，10-3，10-4菌液，分别将10-3，10-4菌液涂布到初筛培养基上，每个梯度涂布2块平板，分别放入28℃、35℃培养20 h左右观察结果。用接种环从实验项目一的平板上选择一个能产水解圈的菌株在选择平板上划线分离。（每人划1~2个平板）

6. 产纤溶酶菌株的分离纯化

7. 产纤溶酶菌株的菌落形态观察及菌种保存

将上述划线后的平板放入37℃培养箱培养20 h后，将平板拍照，接种其中最为典型的菌株划线保存在试管斜面上；观察产纤溶酶菌株在选择平板上的菌落形态，并对其进行描述。

一、基本原理

1. 不同类型的纤溶酶都能在初筛平板上形成水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是纤溶酶的高产菌株，因此要进行酶活测定复筛。

2. 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

二、实验目的

学习采用福林试剂测定纤溶酶活力。

三、实验器材

1. 原料

产纤溶酶菌株

2. 溶液和试剂

蛋白胨，牛肉膏，琼脂粉，氯化钠，干酪素，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，硼砂，酪氨酸，蒸馏水等。

3. 仪器和用品

三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器

四、操作步骤

1. 选择平板的配制（%）：大豆蛋白胨 1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白

2.0，琼脂粉2.0，121℃，灭菌15 min。（200 mL×2）预备实验1（杨华、王金新）

2. 扩大培养基的配制（%）：大豆蛋白胨 1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，15×150的试管装6 mL，121℃，灭菌15 min。（150 mL，分装成25支试管，每6 ~ 7支一包）预备实验1（杨华、王金新）

3. 发酵培养基的配制（%）：大豆蛋白胨 1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121℃，灭菌15 min。（1200 mL，分装成24个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）预备实验1（杨华、王金新）

4. 菌液的制备

用接种环从试管斜面上挑取一环菌株，在选择平板上划线，37℃倒置培养20 h，挑选有明显水解圈的单菌落转接入试管扩大培养液中37℃震荡培养6 h，转接入装有50 mL发酵培养基的三角瓶中继续37℃震荡培养16 h，4℃，5000 rpm离心10 min，取上清液用于纤溶酶活力的测定。

5. pH7.2磷酸缓冲液的制备预备实验2（邓海、张娟）

取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸馏水稀释1倍，即为pH7.2磷酸缓冲液。

A液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）称取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。

B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）称取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。

6. Folin试剂的配制预备实验2（邓海、张娟）

6.1 Folin试剂

在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL 浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。

6.2 Folin试剂使用液

使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。