血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

生物化学实验报告

姓名：学

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生物化学与分子生物学实验教学中心

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一、实验目的

1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理

1、粗提（盐析法）：

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的

2、脱盐（凝胶层析法）

凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量

较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE 纤

维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。

4、纯度鉴定（电泳）

采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。

三、材料与方法：以流程图示意

材料：

1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）

2、试剂：0.3mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的PH6.5 醋酸铵缓冲液、1.5mol/L 的NaCl-0.3mol/NH 4Ac 溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L （20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2 溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。

3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

结果：

1、粗提（盐析法）:如图1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊，

呈乳白色。离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图3），

沉淀为白色。如图2 所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水

图1 血清加饱和硫酸铵溶液图2 分离上清液和沉淀

2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图 5 所示，往层析柱中加

样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约0.5cm。与葡聚糖凝胶G-25 层析柱相对比，DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图

6 所示，往磺基水杨酸和BaCl2 溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的 1 管球蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。

图5 DEAE-纤维素层析柱图6 磺基水杨酸和BaCl2检测蛋白质呈阳性

（红色圆圈为磺基水杨酸，蓝色圆圈为BaCl2 溶液）4、纯度鉴定（电泳）：如图7 所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。如图8

所示，染色后，薄膜上可见5 条深蓝色横纹

图7 直流稳压电泳仪

讨论：

1、操作失误： 1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而 是接着倒入了 1ml 0.02mol/L NH 4Ac 缓冲液，导致球蛋白被稀释。

2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。

3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。

2、注意事项：

1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉 淀物。 2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床 /纤维素床表面，以免空气进入凝胶床 / 纤维素床。

3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒 /纤维素粒冲起，破坏凝胶床 /纤维素床表面的 平整。 4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样 品会被稀血清

清蛋白 第 1 管

清蛋白第 2管

白

γ-球蛋

释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。

5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和BaCl2 检验流出液是否含有蛋白质，以免蛋白质流失过多。

6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。

7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效果。

8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。

9）点样时应做好标记，以免弄混。标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。

3、讨论题：

1）硫酸铵盐析一步, 为什么是0.8ml 血清加0.8ml 饱和硫酸铵?

在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，γ-球蛋白沉淀，0.8ml 血清和0.8ml 饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。但硫酸铵会水解呈酸性，如果浓度大的话酸性也很强，可能使蛋白质变性。若将血清加入饱和硫酸铵，会使部分血清蛋白变性。所以要将硫酸铵慢慢加入血清，边滴加边摇匀。

2）为什么实验中DEAE 纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生, 可直接用于纯化清蛋白?

DEAE 纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。γ-球蛋白带正电荷，不与DEAE 结合，会从层析柱中首先洗脱出来，所以可直接用于纯化清蛋白。

3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度, 根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?

正常人血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可获得5 条区带。γ-球蛋白的等电点约为7.3，在pH8.6 的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢。而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3，在电场中比γ-球蛋白移动速度快。其中清蛋白等电点为

4.88，带负电荷最多，速度最快。且清蛋白在血清中含量最多。所以离点样线最近的是γ-球蛋