第9章 原生质体培养和体细胞杂交

制备原生质体的酶类
纤维素酶：自绿色木霉提取 果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从 根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可 从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组 织分离原生质体
酶溶液的配制
第四节 原生质体融合与体细胞杂交
体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合 制造杂种的方法。 原生质体融合： 1、自发融合 2、诱发融合： 异核体（hetrokaryon）：不同来源原生质体融合形成的 杂种原生质体。 ① NaNO3处理：异核体形成的频率不高 ② 高pH-高浓度钙离子处理：高pH可能对原生质体有毒 ③ 聚乙二醇（PEG）处理：形成双核异核体的比例很高。
第九章 原生质体培养和体细胞杂交
原生质体：植物细胞中，除细胞壁以外的成分 原生质体研究的意义： 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、 染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便 的遗传操作实验系统
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞 发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱 离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。 缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法（在第一节详述） 1960，Cocking最先采用
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 来自百度文库解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。
选择杂种细胞的方法
1、利用对外源激素的要求不同进行选择 2、利用生长习性和愈伤颜色不同进行选择 3、利用突变细胞系互补进行选择 4、根据原生质体形态机械分离杂种原生质体
体细胞杂种的鉴定
1、形态学观察 2、育性检查 3、染色体数目和核型检查 4、生化与分子生物学检测
胞质杂种
胞质杂种（cybrid）：利用不对称细胞融合技术，有可能 使一个亲本的原生质体和另一个亲本的细胞质结合在 一起，这种具有一个亲本的细胞核和两个亲本的细胞 质的体细胞杂种叫做胞质杂种。 胞质杂种通过三种途径产生： 1、一个正常的原生质体和一个去核的原生质体融合 2、一个正常的原生质体和一个核失活的原生质体融合 3、在融合以后的某一阶段一亲本的核或染色体被排除。
第二节 原生质体的培养方法 1
1、供体材料：单双子叶植物有所不同 2、培养基 ① 无机盐：大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有 机氮源。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。 ②碳源和渗透压：葡萄糖最适合，应过滤消毒。原生质体培养，必 须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。 ③有机附加物和激素：VB1、VB6、烟酸是必需的。很多时候，只需 要生长素，尤其2,4-D ④条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去 细胞的培养液 ⑤pH：5.6～5.8，以MES、葡聚糖硫酸钾等调节 ⑥常用基本培养基：KM8p和NT KM8p：高国楠建立，用于豆科和禾谷类原生质体培养 NT：双子叶植物原生质体培养 培养基通常过滤消毒 ⑦ 培养的原生质体密度 培养单个原生质体之前，最好在高密度下培养数天。
预处理方法
1、枝条暗处理 获得的原生质体有活力，并能继续分裂。 2、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离 3、叶片预培养 叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养 一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。 4、预先质壁分离处理 先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原 生质体释放，提高其活力。 5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体， 质量好，分裂频率高。
体细胞杂交技术在农业上应用
1972，Carlson第一次获得体细胞杂种植株 1、合成新物种 2、培育抗病新种质 3、胞质杂种在育种上的利用
原生质体培养的成果
1971，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株，并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
第一节 原生质体的分离
1、材料来源及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状 态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率， 减少原生质体损伤。
为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要 求酶液满足以下条件： 1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似 同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透 压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低。 可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。 2、酶液添加CaCl2·2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾以提 高原生质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产 生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻O2‾自由基对细胞 膜损伤，从而提高原生质体植板率。 3、MES（吗啉乙基磺酸）作为pH缓冲调节剂对于保持 酶解物的酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放 量和稳定性。 4、酶溶液最适pH范围为5.4~5.8 酶液配好后，过滤灭菌备用。
原生质体的培养方法 2
2、培养方式： ① 固体培养：琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质 体的再生、生长和分裂，但分裂慢，操作繁琐。 ② 液体浅层培养：简单，对原生质体损伤小，易于添加 新鲜培养基和转移培养物，但原生质体分布不均，易 粘连，难以定点追踪。 ③ 微滴培养（droplet culture):可进行多组合试验， 可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发， 可覆盖矿物油。 ④ 滋养培养（nurse culture):利用能分泌生物活性物 质的细胞或组织培养物作为滋养者，促进原生质体的 分裂和生长。