核酸转膜、探针标记、

Southern印迹杂交（ Southern blot）
Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传 诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分 析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法 是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶 电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液 中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝 酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶 中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程 中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针 杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带 的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特 定序列的DNA片段的位置和大小。
实验 八、九 核酸转膜、探针标记、 分子杂交
实验目的
学习核酸杂交技术的相关知识及其重要 性，掌握点杂交的转膜方法、探针的标 记以及分子杂交操作过程。
相关知识
核酸杂交技术基本上是从Hall等1961年的工 作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通 过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、 费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的 研究。 60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记 DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC） 膜上的DNA序列奠定了基础。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝 酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌 以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交 信号，并与平板上的菌落对位。
点杂交法（Dot blot）
70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了 突破性进展，限制性内切酶的发展和应用使分子 克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质 粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的 来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库 和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌， 便可提取大量的探针DNA。由于固相化学技术和 核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～ 100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和 Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异 基 因 。 特 异 DNA 或 RNA 序 列 的 量 和 大 小 均 可 用 Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的 技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。
预杂交和杂交
• 注意1：取膜要用镊子小心的夹取膜的角。 在各步骤之间最好将镊子在乙醇里浸泡 并使其干燥。杂交之后、洗膜之前换洗 膜的容器会使杂交结果更干净； • 注意2：在杂交、洗膜和检测期间不要让 膜干燥； • 注意3：杂交缓冲液在杂交期间可能变色。
1. 室温下， 将等体积的North2South 直接杂交缓 冲液成份1与成份2(North2South® Direct Hybridization Buffer Component 1,2)混合， 配成足以覆盖膜的杂交缓冲液，每cm2至少 0.1ml。混合（容器）并于55°C温育； 2. 温育杂交缓冲液至少5分钟后，加入膜并在适当 温℃下预杂交至少15分钟，同时轻柔搅动（振 荡或翻转）。确保膜均匀接触缓冲液。杂交缓 冲液包含封闭试剂，因此这步包括封闭和预杂 交两步； 3. 预杂交（步骤2）之后，加入HRP标记的探针， 每ml杂交液中DNA 探针8ng (5 - 10 ng )；
试剂盒包含Northern 和Southern杂交中标 记与化学发光所需试剂。
操作步骤示意图
探针制备：
1. 10ng 溶于10μl水中的DNA 在95℃变性5分钟。然后在 冰上放置5分钟(为得到好的结果，标记的核酸中不能有 蛋白污染，而且应溶解在极纯的水中。如果含盐的浓度 大于10mM将影响标记反应); 2. 加入10μl North2South® Direct Stabilized HRP 标 记液; 3. 加入10μl North2South® Direct Reaction Buffer。 4. 45-50℃温育15分钟或37℃30分钟。注意：在加入酶稳 定剂前不要用冰冷却探针，否则将在膜上出现小斑点。 5. 加入30μl North2South® Direct Enzyme Stabilizer, 混匀。探针浓度为1.67ng/μl; 6. 稳定剂加入后将探针冻起来或立即使用。未用的探针可 以冻存。在再次使用或再次冻存时混匀。
3. 准备杂交膜：（注意：带无粉末的手套， 用乙醇清洗过的镊子来操作膜）a. 用 45μl 0.1N NaOH稀释 5μl 变性DNA，使 其浓度为10ng/μl，按此方法用0.1N NaOH逐级稀释（10，5，2.5，1.25，0.63， 0.3，0.1ng/μl）。 b.分别将各稀释样 品点1μl于膜上。虽然干膜也可以得到结 果，最好还是预湿膜，在半干的时候点样。 c.在1ⅹTE中快速（10秒）润洗。微波炉 高热2分钟，紫外交联或干烤固定2小时。
3. 排除膜表面的底物，并将湿润的膜转至一个 干净的塑料膜中包好。排除膜内的气泡和皱 褶，并吸干从膜边缘漏出的底物。 4. 将用塑料膜包好的膜放入胶卷盒，暴光1分钟。 暴光时间可根据需要延长或缩短。
5. 将胶卷从盒中取出、冲洗。
转膜 是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将 核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将 核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步 骤之一。
探针的标记
探针的标记方法：缺口平移、DNA快速末端标记、 用T4多核苷酸激酶标记DNA 5’末端、随机引物延 伸、聚合酶链反应。 核酸探针的种类：DNA探针、cDNA探针、RNA探针、 寡核酸探针。 在选择标记方法时，应考虑实验的要求，如灵敏 度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射 性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时， 应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。 在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物 素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或 过氧化物酶系统。
底物显色 1. 制备化学发光工作液，将等体积North2South发 光/增强溶液(North2South® Direct Luminol/Enhancer Solution)与North2South稳 定过氧化物溶液(North2South® Direct Stable Peroxide Solution)混合。制备足够的溶液以便 完全覆盖膜（大约0.1ml/cm2）。工作液在室温 下至少稳定6小时。 2. 将湿润的膜放在一个干净的塑料膜或托盘上，以 North2South底物工作液覆盖，室温下温育5分钟。 确保膜充分接触底物。
点杂交法是将被检测标本点到膜上，烘烤固定。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上 可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市 售有多种多管吸印仪（manifolds），如 Minifold I和II、Bio-Dot (Bio–Rad )和 Hybri–Dot,它们有许多孔，样来自百度文库加到孔中，在 负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复 冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定 标本，这时的膜就可以进行杂交。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞 的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原 位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加， 让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此,原 位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空 间位置，这一点具有重要的生物学和病理学 意义。例如，与细胞RNA的杂交可精确分析一 种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位 杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微 生物存在方式和部位的一种重要技术。
实验材料及试剂： • • • • • 用于点样的DNA (质粒DNA)， 用于标记的DNA（PCR产物)， 杂交膜， UV-Cross Linker或烤箱， North2South Direct HRP Labeling and Detection Kit(chemiluminescent detection)该
Northern印迹杂交（Northern blot） 这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975 年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术 正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂 交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot。Northern印迹杂交的RNA吸印与 Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在 进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性， 而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。 RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜 结合以及保持其单链状态。
注意：在加入杂交缓冲液之前，不要加热 HRP标记的探针。标记探针之后，核酸 双链不会复性。不需要加热，否则将 使HRP失活。 4. 在适当温度下温育1小时（可延长至4 小时），同时轻柔搅动（振荡或翻 转）。不要温育超过4小时。
洗膜 1. 杂交之后，将膜转到一个新的盛有洗膜缓 冲液（2XSSC / 0.1%SDS）的容器中。在 与杂交相同的温度下，用40ml（约0.5 ml/cm2）缓冲液洗膜三次，每次5分钟。 2. 在室温下，用2XSSC洗膜三次（约0.5 ml/cm2），每次5分钟。
杂交的方法：
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 、 点杂交（Dot blot）、Southern印迹杂交 （ Southern blot ）、Northern印迹杂交 （Northern blot）、组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等。
目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用 于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、 组织病理学的研究、生物分类方面。
核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价 键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此 之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同 源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA与DNA（Southern blot）、RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链 之间进行。
杂交前准备：
1. 使用前使所有的试剂温度达到室温; 2. 将杂交炉和保温装置调到合适温度; 3. 准备洗涤缓冲液： 2X SSC/0.1%SDS：100ml 20X SSC + 10ml 10% SDS +890ml water 加热至杂交温度。 2X SSC: 100ml 20X SSC + 900ml H2O
由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行 分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单 链，这一过程称为变性，一般通过加热或提 高pH值来实现。使单链聚合成双链的过程称 为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量 分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位 素或非同位素标记成为探针，再与另一种核 酸单链进行分子杂交。
DNA点膜 1. 试剂准备: 1N NaOH，2ⅹSSC-200ml@RT， 2ⅹSSC/0.1%SDS 200ml@55℃ 2. DNA变性（pCMV-Myc-T10,250ng/μl,5μl） 为单链形式:在无DNA酶的1.5ml管中，将 0.8μlDNA和20μl无核酸酶的水混合，使终 浓度为10ng/μl。煮沸5分钟，立即在冰上 冷却5分钟。