淋巴细胞提取
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。
下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。
- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。
- 为实验准备足够数量的外周血样本。
2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。
- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。
3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。
- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。
4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。
5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。
- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。
- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。
6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。
- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。
- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。
请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。
在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。
同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。
希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程一、引言淋巴细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，具有重要的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功能。
因此，对淋巴细胞的提取和分离工作具有重要的研究意义。
在淋巴细胞的提取中，由于血浆与血红细胞的存在会对淋巴细胞的获取造成一定的干扰。
因此，要达到对淋巴细胞的高效提取，需要采取一系列的实验步骤和具体操作。
本文将对抗体阴性淋巴细胞提取流程进行详细介绍。
二、实验前准备1.1实验材料准备- Ficoll-PaqueTM Plus（细胞分离介质）- PBS（磷酸盐缓冲盐水）-血样- 10% PBS-蒸馏水1.2实验仪器准备-离心机-定速摇床或转速可调摇床-干燥箱-显微镜三、实验步骤2.1血样处理将血样加入培养皿中，使用相等量的PBS进行稀释。
然后缓慢地将血样混合，加入Ficoll-PaqueTM Plus细胞分离介质，并进行离心分离。
2.2离心分离淋巴细胞在培养皿中离心分离血样，分离过程中将产生三个层次：上层为血浆、中层为Paque介质混合液，下层为红细胞。
使用无菌吸头吸取中层细胞分离介质中的淋巴细胞，放入新的离心管中，加入PBS缓冲液，并进行第二次离心。
2.3清洗淋巴细胞将混合液倒入新的离心管中，加入PBS进行清洗，然后进行第三次离心。
将洗涤后的混合液分装至新的含有PBS的离心管中，加入PBS 至适量。
2.4定速摇床培养将含有PBS的离心管置于定速摇床中，培养2-3小时，温度为37°C。
培养结束后，用显微镜观察淋巴细胞是否完整。
2.5抗体阴性淋巴细胞识别与提取将培养后的淋巴细胞离心，去除PBS，加入10% PBS进行混合，然后进行第四次离心。
将产生的沉淀液中的淋巴细胞加入10% PBS中，进行细胞计数，计算淋巴细胞的浓度。
2.6细胞提取根据实验需要，进行对抗体阴性淋巴细胞的提取。
根据实验目的和具体情况，可以采用不同的提取方法，比如磁珠法、流式细胞术等。
通过相应的实验方法，可以实现对抗体阴性淋巴细胞的提取。
从外周血淋巴细胞中提取RNA
从外周血淋巴细胞中提取RNA
实验概要
本实验从外周血淋巴细胞(PBls)中分离得到RNA样品。
实验步骤
1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。
2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。
3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞)，然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。
4．加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂，4℃孵育15～20小时(过夜)。
5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。
6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。
用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬，收集沉淀.将沉淀重悬液离心，6500r/min1小时。
7．弃去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。
在-20℃下，彻底冷冻悬液。
8．复溶悬液，每10分钟涡旋20秒，共45分钟。
9．用等体积酚抽提1次，并用等体积氯仿抽提1次。
10．加入1/10体积的3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积一20℃乙醇。
彻底混合溶液，并在-20℃下孵育过夜。
11．在吊桶式转头内离心RNA，12000r/min30分钟。
用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。
将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内，并加入1/10体积3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积-20℃乙醇，重新沉淀。
并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至准备使用时。
一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应用和方法
一种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应用和方法
肠道固有层淋巴细胞在小鼠免疫系统中起着重要的作用。
为了更好地研究这些细胞，科研人员开发了一种高效的试剂，用于提取小鼠肠道固有层淋巴细胞，并深入探讨其应用和方法。
这种试剂的开发旨在提高提取过程的效率和细胞存活率。
经过多次实验和优化，科研人员成功地开发出了一种配方，能够快速、可靠地提取小鼠肠道固有层淋巴细胞。
该试剂含有一系列活性成分，能够迅速分离细胞，同时保持细胞的完整性和功能。
通过这种试剂的使用，研究人员可以更准确地分析肠道固有层淋巴细胞的特性和功能。
该试剂的应用范围广泛。
在免疫学研究中，肠道固有层淋巴细胞被认为是调节免疫平衡的重要细胞类型。
通过使用这种试剂，研究人员可以更好地了解肠道固有层淋巴细胞的分布、数量、表面标记物及其功能。
这对于研究肠道免疫相关疾病、肠道菌群和营养吸收等方面具有重要意义。
使用这种试剂提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的方法相对简单。
首先，需要将小鼠的肠道组织取出，并去除周围组织。
然后，将组织切割成细小的碎片，并与试剂混合。
混合物经过一系列处理步骤，包括酶解、过滤和离心等，最终可以得到纯净的肠道固有层淋巴细胞。
这种方法简便、高效，能够在较短的时间内得到大量的细胞。
总结起来，这种提取小鼠肠道固有层淋巴细胞的试剂及其应用和方法为肠道免疫学研究提供了有力的工具。
它不仅提高了提取的效率和细胞的存活率，还为研究人员提供了更深入的了解肠道固有层淋巴细胞的机会。
随着这种试剂的广泛应用，相信对于肠道免疫相关疾病的治疗和预防将有所帮助。
提取淋巴细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。
本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。
2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。
3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。
4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。
肿瘤浸润淋巴细胞提取方法
肿瘤浸润淋巴细胞提取方法
提取肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的方法主要包括以下步骤：
1. 肿瘤组织获取前准备工作：平衡培养基和Ficoll-Paque分离液至室温（18-20℃），这是因为在实验中温度会影响密度梯度分离获得的单核细胞的产率，温度过低容易出现红细胞污染，过度过高会降低淋巴细胞产量和活力。
此外，根据种属和细胞类型来选择适合的Ficoll-Paque分离液，例如Ficoll Plaque PLUS广泛用于分离人类单核细胞，小鼠的淋巴细胞密度高于人类，因此建议使用Ficoll Paque PREMIUM从小鼠肿瘤组织中分离TIL。
2. 酶工作液的配制：提前以RPMI-1640或PBS缓冲液配制10×细胞消化液并置于-20℃储存。
包括胶原酶、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶等，每种酶都有一定的工作浓度。
3. 肿瘤组织的处理：把肿瘤组织制成单细胞悬液，可用机械和酶消化法获得瘤组织的单细胞悬液。
4. 密度梯度离心法分离TIL：利用密度梯度离心法等分离纯化TIL，该方法具有简便、快速、有效等特点，且获取得细胞活力高，功能完整。
以上方法仅供参考，具体操作需要依据实验环境和条件进行调整，建议咨询专业人士获取准确信息。
一种改良的小鼠肠道上皮内淋巴细胞的提取方法
一种改良的小鼠肠道上皮内淋巴细胞的提取方法我折腾了好久一种改良的小鼠肠道上皮内淋巴细胞的提取方法，总算找到点门道。
首先得跟你们说啊，我一开始真是瞎摸索。
我试过直接按照传统方法来，就是那种最普通的流程。
我琢磨着这东西能有多难呢，对吧？结果啊，真不是那么回事儿。
那提取出来的细胞质量和数量都不行，就好像你要从一堆沙子里找特定的几颗小珠子，结果发现这堆沙子里夹杂着好多石子和其他杂质，完全达不到我想要的纯度和量。
我就想啊，问题出在哪呢？后来我意识到，在开始怎么处理小鼠肠道这块儿就是一个关键。
传统那种把肠道取出来再怎么怎么处理的方式可能有点粗暴了。
我就改变策略，我在取肠道之前，先给小鼠喝点特殊的溶液，这个溶液的配比我可是琢磨了好久，就像是厨师在调整调料的用量来让菜品更美味一样。
这个溶液我觉得有点像给肠道细胞先搞一个预处理，让它们变得更易于我之后的操作。
比如说，里面的一些成分像是柔和的清洁剂，可以把肠道表面那些可能会影响淋巴细胞提取的东西先清洁掉一部分，但又不会伤害到细胞。
然后就是提取过程中的机械处理。
原来我就按照人家说的标准振荡啊、搅拌啊，可是我发现这样很容易把淋巴细胞弄伤了。
就好比你摇盒子里的鸡蛋，摇得太狠鸡蛋就破了一样。
后来我就找了比较柔和的仪器，转速和振荡幅度都经过不断尝试。
我从低转速开始，比如说100转每分钟试了试，发现不行，细胞没怎么被分离出来。
然后我试到300转每分钟的时候，好像有点意思了，但是还不够好。
最后我定在400转每分钟左右，这时候就能比较好地把淋巴细胞从肠道上皮那边给慢慢分离出来，还不至于让它们破损。
还有啊，在分选细胞的时候，我最初用的那个标记物不是特别精准。
我原以为只要是稍微沾点边的标记物应该就问题不大吧，实际不然。
选用更特异性的标记物就像是在一群穿着同样颜色衣服的人里，用一个特别的小标记来辨认出你要找的那个人一样，这样就能把上皮内淋巴细胞精确地分选出来了。
这里我还要说一个我犯过的错啊。
封闭抗体阴性 淋巴细胞提取流程
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程1.在实验室的无菌条件下，取出外周血样本。
In a sterile laboratory environment, take a peripheral blood sample.2.将外周血样本放入离心管中，轻轻旋转离心管混合均匀。
Place the peripheral blood sample in a centrifuge tube and gently mix by rotating the tube.3.将混合后的外周血样本放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。
Centrifuge the mixed peripheral blood sample at 3000 rpm for 10 minutes.4.取出上清液，放入新的离心管中。
Remove the supernatant and place it in a new centrifuge tube.5.向上清液中滴加等体积的PBS缓冲液，轻轻旋转混合。
Add an equal volume of PBS buffer to the supernatant and gently mix by rotating.6.将混合后的上清液＋PBS溶液放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。
Centrifuge the mixed supernatant + PBS solution at 3000 rpm for 10 minutes.7.取出上清液，弃渣，得到淋巴细胞。
Remove the supernatant, discard the sediment, and obtain lymphocytes.8.将淋巴细胞放入新的离心管中，加入PBS缓冲液洗涤。
Place the lymphocytes in a new centrifuge tube, and wash with PBS buffer.9.重复以上洗涤步骤2-3次，以去除残留的血液成分。
qPCR 样本处理(1) 人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
qPCR 样本处理(1) 人外周血淋巴细胞RNA的提取方法qpcr样本处理(1)----人外周血淋巴细胞rna的提取方法人外周血淋巴细胞rna的提取方法一、收集血样，室温留存。
采用一次性的抗凝的真空扣血管展开献血。
通常采用edta 或肝素抗凝均可；血量通常为1ml；通常地，1ml外周血中所含大约1-2*10^6个单个核细胞（pbmc，即为淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
取1.5ml无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ulpbs（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。
然后缓慢把混匀的血样pbs混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从收集血样至已经开始实验的时间最出色不少于4小时。
实验过程中一直维持室温条件，通常20摄氏度比较相对较低，因为细胞的拉沙泰格赖厄县温度就是体温37摄氏度，但是温度减少又可以减少细胞的新陈代谢，两者有些矛盾，所以挑中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞拆分液就是一种根据细胞密度差异，利用Vergt产生的重力加速度，展开细胞的拆分提纯的常用试剂，为具有乳光或微乳光的杀菌水溶液，主要成分就是葡聚糖与和泛影酸葡甲胺。
1.提取淋巴细胞步骤
提取大鼠淋巴细胞的步骤：1.准备工作：将实验用具（小剪子3把，小镊子3把，磁盘1个，离心管1盒，离心管盖1盒，筛网1盒，表面皿1组，注射器2支，手套1副，1000ul枪头1盒，200ul枪头1盒，10ul枪头1盒，白大褂）放在紫外光下照射30分钟以上。
实验试剂（PBS、无血清的培养液、有血清的培养液、淋巴细胞分离液）准备好。
检查酒精灯内酒精量灯芯、酒精棉量。
脱颈处死，放入酒精中浸泡20分钟（可放到无菌室中）。
3.拿好实验药液（有血清的培养液，无血清的培养液，PBS，淋巴细胞分离液）进入无菌室，穿好白服套袖，于手上身上喷好酒精消毒，进入操作台，擦拭台子，台子干后点燃酒精灯。
（缓冲液，生化反应中以免影响体系PH值波动），将大鼠取出至于磁盘中，于腹中线剪开皮毛，向左侧剪开，用镊子在大鼠左侧找到长条状的脾脏，将脾脏至于PBS中分离结缔组织。
注意：勿将脾脏接触到皮毛引起污染，结缔组织尽量去除干净200目），浸湿，用镊子夹取脾脏至于筛网上，用第一个注射器芯将其碾碎干净（碾碎至筛网上剩余物质为白色），吸取无血清培养液2mlPBS的无用表面皿中。
注意：夹取脾脏的镊子不可以碰到筛网以外的液体中，以免污染组织；注入培养液时不要产生气泡（气泡会影响细胞生长）。
6.避光条件下，第二个注射器吸取3ml淋巴细胞分离液（先注入气体再抽取液体）加于离心管中（加4个）。
将装有组织液的表面皿倾用新的一二混用注射器吸取3ml缓慢注入离心管中，一定要让界面明显。
7.稳拿离心管放入离心机中，离心（2500r/min，20min）。
注意：动作稳，配平时找放的稳得离心管。
若脾脏的状态不好，可适当增加离心转数（3000）。
8.稳稳拿出离心管，用200ul 的枪吸取离心管中处于中间的淡黄色条带（先排气后插入吸取液体，一般能吸取500-600的液体），集中收于第五、六个离心管中，9.离心（1500r/min，10min），慢弃上清（倒入刚才的表面皿中），加入PBS 6-7ml反复吹吸充分，离心（1500r/min，10min）。
b淋巴细胞提取)多态性
T、B淋巴细胞分离试验2006-12-28 00:00:00 来源：评论：0我要评论淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC…∙∙PCR实验交流核酸实验交流细胞实验交流蛋白实验交流免疫实验交流生物软件交流淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。
再经淋巴细胞分层液分离时，AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。
材料及试剂：a)新鲜豚鼠血b)兔红细胞（RRBC）c)溴花二氨基异硫氢化物（AET）d)淋巴细胞分层液e)其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。
方法：1.AET—RRBC制备（1）.AET溶液的制备称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4NNaOH溶液调pH9.0。
该溶液必须新鲜配制，不宜久存。
（2）.AET处理RRBC取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。
取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2厘米）1800转/分离心5分钟。
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血T淋巴细胞提取是指从人体外周血样本中分离并纯
化T淋巴细胞的过程。
T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有调节免疫应答和击杀感染性病原体等功能。
通过对外周血中
T细胞的提取，可以进一步研究其功能和特性，并在免疫治疗、细胞治疗等领域应用。
人外周血T淋巴细胞提取的具体步骤包括：
1. 采集外周血样本：使用采血针或血管穿刺等方法从患者或捐赠者的外周血中取得样本。
2. 血液分离：采用离心等方法将血液分离为红细胞、白细胞和血浆等不同组分。
3. 白细胞富集：采用离心梯度离心或负选择等技术将白细胞富集到一定程度。
4. CD3阳性细胞筛选：使用单克隆抗体等与CD3表面分子结合，利用磁珠或荧光标记等方法对T细胞进行筛选，获得
CD3阳性的T细胞群体。
5. 细胞纯化：通过进一步的磁珠或荧光标记等技术，对T细
胞进行纯化，去除其他污染细胞，得到较纯的T细胞群体。
在人外周血T淋巴细胞提取的过程中，需要严格的操作和消
毒措施以确保样本的无菌和安全性。
此外，细胞提取后的T
细胞可以进一步用于细胞培养、分化、鉴定等实验操作，用于研究和治疗目的。
免疫淋巴细胞的提取与染色
下孵育 30min，4500rpm 离心 5min，去上清，用 1mL 1xPBS 洗两遍，300L 1xPBS 重悬。
*培养基 + -巯基乙醇 + 青霉素&链霉素：500mL 1640/IMDM + 1.75L -ME + 5mL 双抗 （1:100,100g/mL）
培养诱导 Th17 细胞&染色：
6
洗一遍。 加入 2%甲醛溶液固定 T 细胞。 （胞内染色）加入 saponin（O.5%） ，室温下孵育 30min，4500rpm 离心 5min。去上清， 加入流失抗体（PE-IFN-等，0.1g/10 cells，一般 1:200） ，4℃下孵育 30min，4500rpm
6
6
6
7
离心 5min，用 1mL 1xPBS 洗一遍。 8. 加入 1mL 2%甲醛溶液固定 T 细胞，室温避光 30min。 9. （胞内染色）加入 1mL saponin（O.5%） ，室温下孵育 30min，4500rpm 离心 5min。去上 清，加入 50L 流失抗体（PE-IL-17 等，0.1g/10 cells，一般 1:200 稀释） ，4℃下孵
amphotericin-B : original concentration = 20mg/ml metronidazol : dissolved under 40-45℃ about 30 minutes ampicillin : dissolved in drinking water, and replaced every 4-5 days metronidazol and ampcillin : placed under the conditions of protection from light all antibiotics except neomycin are needed to save in 4℃
外周血淋巴细胞提取原理
外周血淋巴细胞提取原理外周血淋巴细胞提取是一种常用的细胞学研究方法，主要用于分离和提取外周血中的淋巴细胞，以进行细胞学、免疫学和分子生物学等方面的研究。
外周血淋巴细胞是一类具有免疫功能的白细胞，对维持机体免疫稳态和抵御外界病原体具有重要作用。
外周血淋巴细胞提取的原理主要基于淋巴细胞与其他血细胞在密度上的差异。
外周血中的细胞可通过密度梯度离心法进行分离。
具体而言，可以利用离心管中梯度浓度逐渐增大的离心液，将外周血样品缓慢地均匀地叠加于离心液上，然后进行离心分离。
离心过程中，不同密度的细胞会在离心液中沉降到不同位置，从而实现细胞的分离。
在外周血淋巴细胞提取中，最常用的离心液是Ficoll-Paque，它是一种高分子量的化合物，能够形成密度梯度。
Ficoll-Paque具有较高的溶解度和稳定性，可以有效地分离出淋巴细胞和其他血细胞。
实验步骤如下：1.取出外周血样品，将其稀释至适当浓度。
2.将稀释后的外周血样品缓慢地加入离心管中，避免气泡的产生。
3.离心管中的外周血样品加入适量的Ficoll-Paque，使其形成密度梯度。
4.进行离心分离，通常离心速度为400-800g，离心时间为20-30分钟。
5.离心结束后，可以观察到离心管中分层的细胞。
6.利用取样器或移液管从离心液上层吸取淋巴细胞，放入无菌的离心管中。
7.加入等体积的无菌PBS缓冲液洗涤淋巴细胞，离心洗涤后的淋巴细胞沉淀。
8.去除上清液，留下淋巴细胞沉淀，即可用于后续实验。
通过上述步骤，我们可以顺利地提取出外周血中的淋巴细胞。
提取后的淋巴细胞可以用于细胞培养、流式细胞术、PCR等实验，以研究淋巴细胞的功能和机制。
需要注意的是，在进行外周血淋巴细胞提取实验时，应严格遵守无菌操作规范，以避免外源性污染对实验结果的影响。
此外，提取的淋巴细胞应及时进行后续实验，以保证实验结果的准确性。
总结起来，外周血淋巴细胞提取的原理是基于细胞密度差异，通过密度梯度离心分离淋巴细胞和其他血细胞。
PBMC
PBMC分离图片
密度梯度离心法分离PBMC
5. 去除部分上层液体，余下约1mL，用移液器 插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心 管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10 分钟，洗涤细胞两次。
6. 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液ห้องสมุดไป่ตู้ 室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量 增减时间。
Fig： FACS-assisted viscRNA-Seq workflow on PBMCs from DENV-infected and healthy control human subjects.
3、总结
（1）大部分只做了单独的PBMC的淋巴细胞亚 群，并没有把组织和PBMC做对比。
（2）High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy
PBMC最新研究进展
汇报人：郭艳菊 日期：1月7日
1.PBMC的提取方法 2.PBMC在单细胞测序的文献搜索
1、提取方法
外周血中提取人淋巴细胞（PBMC）的方法主 要有：Ficoll密度梯度离心法，percoll分层液法。 （1）percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮（ PVP）处 理的硅胶颗粒，利用percoll液经高速离心后形成 一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分 离纯化。Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害， 因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病 毒。 （2）Ficoll密度梯度离心法：利用一种介于1.0751.090之间的聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺 （Urografin）（F／H）分层液作密度梯度离心， 离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布， 常用来分离外周血单核细胞。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验是一种常用于免疫学研究的技术。
该技术通过分离人或动物的淋巴组织，提取淋巴细胞，可以进行多种免疫学实验，如细胞增殖、细胞毒性等。
淋巴细胞分离技术最早是由Ficoll-Paque首创的。
本次实验中，我们基于Ficoll-Paque梯度离心分离技术，通过在人血液样本中离心沉淀淋巴细胞，进而提取出淋巴细胞。
实验步骤如下：首先，我们从志愿者的血液中提取出血浆和白细胞。
接着，我们添加PBS缓冲液，缓慢倒入Ficoll液，最后加入血浆和白细胞混匀后，将试管进行离心。
在离心的过程中，血液中的重质量分别在上下两个相邻稠度梯度之间分离开，从而使淋巴细胞与Ficoll液相互分离，最终沉淀到离心管梯度底部。
接下来，我们将离心管倾斜45度，使用洁净的滴管吸取淋巴细胞。
我们将沉淀的细胞用PBS缓冲液多次洗涤，去除残留的红细胞和粒细胞等杂质，从而得到较为纯净的淋巴细胞。
分离出的淋巴细胞可以用于多种免疫学实验，包括细胞东西分析、细胞毒性测定、细胞增殖、T细胞识别和细胞培养等。
由此可见，淋巴细胞分离技术是一种非常有用和重要的免疫学技术。
本次实验中，我们还可以从中总结一些技术经验。
例如，血浆和白细胞必须充分混合，并且Ficoll液需要缓慢倒入，以免对细胞造成伤害。
此外，在离心的过程中，需要保持离心时间、离心速度的一致性，同时在取样时要保持管子的倾斜角度不变，以确保淋巴细胞沉淀到尽量下面的梯度面上。
综上所述，淋巴细胞分离实验是一项十分重要的免疫学实验，能够提供纯净的淋巴细胞供科研家们进行相关实验。
同时，淋巴细胞分离技术在使用过程中要注意多方面的因素，保证实验结果的准确性和稳定性。
提取外周血淋巴细胞
/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。
现在大多数用的密度梯度离心法。
一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。
现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
我的经验1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分温度20c －28c时间：20分钟no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)5。
取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。
还有办法的。
8 离心。
转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)时间：10分钟温度：4c9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）10.细胞计数＋洗涤细胞。
刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。
这样是不是很节省时间？？11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
提取结肠固有层淋巴细胞的过程
提取结肠固有层淋巴细胞的过程提取结肠固有层淋巴细胞是一项常见的实验操作，用于研究肠道免疫系统和疾病发生机制等。
以下是提取结肠固有层淋巴细胞的基本步骤：
1.动物准备：选择合适的实验动物（如小鼠、大鼠等），按照实验需要进行处理和麻醉。
2.结肠解剖：使用手术刀具将动物的腹部剖开，暴露出结肠。
将结肠取出并置于含有冷生理盐水或其他细胞培养液的培养皿中。
3.清洗结肠：用冷生理盐水或其他适当的缓冲液冲洗结肠，去除结肠表面的粪便和其他杂质，以减少后续实验的干扰。
4.切割结肠：使用细剪刀或刀片，将结肠切成小块，并转移到含有适当酶解液（如胰蛋白酶、DNA酶等）的培养皿中。
5.酶解结肠：将切割好的结肠组织在酶解液中进行酶解，通常需要在37摄氏度下恒温孵育数十分钟至数小时，以便将结肠组织中的细胞释放出来。
6.过筛过滤：将酶解后的结肠组织经过细孔过滤器（如70μm 的过滤网）过滤，以去除残余的组织碎片和大块细胞，得到较为纯净的细胞悬液。
7.离心分离：将过滤后的细胞悬液离心，通常采用低速离心（如1000rpm，5分钟），以沉淀细胞。
8.去除上清液：将上清液倒掉，保留沉淀的细胞沉淀。
9.淋巴细胞分离：采用密度梯度离心法（如离心上清液于50%离心液和75%离心液的密度梯度上）或磁珠分离法等方法，分离出
结肠固有层淋巴细胞。
10.细胞计数：使用显微镜和血细胞计数板等设备，对分离得到的淋巴细胞进行计数。
11.存储或应用：将分离得到的淋巴细胞用于后续的实验操作，如细胞培养、流式细胞术、免疫组织化学等。
以上是提取结肠固有层淋巴细胞的基本步骤，具体操作中需根据实验目的和动物模型的特点进行调整和优化。
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淋巴细胞提取一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二实验对象：B／C 小鼠三实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。
注意无菌操作。
3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。
用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。
5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。
离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。
倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。
五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。
覆盖层不必太厚，2Μl足矣。
②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。
否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。
其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。
如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。
③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
脾淋巴细胞的制备将试验小鼠摘除眼球放血后，颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中5min；将小鼠固定于解剖板上，无菌打开腹部的皮肤，暴露腹膜，用眼科剪打开腹膜，小心取出脾脏；将脾脏置于已盛有10mL PBS的平皿中，轻轻洗涤并细心剥去周围结缔组织（此步可省略）；将脾脏移入200目铜网缝制的小袋中，用4号针头在脾脏表面扎几个针孔，然后用装在1mL注射器上的弯针头轻轻刮取脾脏，使脾细胞从针孔中溢出并透过铜网进入PBS中，再加入少许PBS，并用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；取脾淋巴细胞悬液1份，小心沿侧壁加入到2份的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心10～20min；收集界面上的细胞（白色云雾层），放入8～9mL盛有Hank’s溶液的离心管中，混匀后，以1500～2000rpm离心5～10min；吸去上清液，沉淀经反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至2-5×10*6个/mL；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100µL/孔。
如何从小鼠的脾脏中提取T 淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。
方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）中T 淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。
结果：LBP 可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。
LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。
LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。
结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。
LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
〔关键词〕枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment T lymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing miceHE Yan Li, YING Yi, XU Yan Li, SU Jun Fang, LUO Hui, WANG Hui Feng(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, China; Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)ABSTRACT Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment T lymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. T lymphocyte subsets and the phenotypes of dendriticcells in tumor infiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBP treated group, the increased number of dendritic cells and B7 1 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has anti tumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the anti tumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.KEY WORDS Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; T lymphocyte subsets; tumor infiltrating lymphocyte; dendritic cells近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。
已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。
但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。
本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
1材料与方法1.1材料昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。