酶细胞化学摘要

三、一些关键问题
或者捕捉底物经锇酸作用后形成高电子密 度的锇黑在电镜下可见
１. 联苯胺色素法和嗜锇物质生成法
氧化酶作用于两种底物（供氢体和受氢体）
供氢体为二氨基联苯胺(DAB)，经一系列氧化聚 合反应后形成联苯胺氧化聚合物，在光镜下呈棕黄 色
DAB嗜锇性很强，经锇酸固定后能生成具有高电 子密度的锇黑
酶 （氧化酶）
型
(萘酚) 固( 红或固蓝)
酶+捕捉底物+四唑盐 色素
(吲哚酚酯)
金属盐
锇黑
电(镜)
第二节 酶细胞化学方法
一、 样品制备 二、 基本实验过程 三、 一些关键问题
一、样品制备
保存细胞结构和酶的位置同时保存酶活性
（一）固定
甲醛类固定剂能较好保持酶活性而且较好地保存细胞 结构
（二）冷冻切片
冷冻切片能较大限度地保存酶的活性，是酶细胞化学 技术中常用的方法
第五章 酶细胞化学技术
Enzyme cytochemistry
酶细胞化学是用细胞化学的方法证明酶的存 在和位置的技术
用酶细胞化学技术可显示酶在细胞内的定位 用于研究细胞器的结构和功能，了解细胞器的相 互关系和进行细胞鉴别并对某些代谢性疾病的诊 断具有一定的作用
细胞器
各种细胞器的标志酶
标志酶
内质网 核苷二磷酸酶 葡萄糖- 6- 磷酸酶
初级反应： 底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸
磷酸水解酶 底物 →→→→→→→→→→ H3PO4
最终反应： 磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物磷酸铅
捕捉剂（Pb2+）
（高电子密度）
H3PO4 →→→→→→→→→→ Pb(PO4)2
（二）色素形成法和嗜锇物质生成法
原理：
在酶作用下，捕捉底物转化成色素沉淀于 酶作用部位在光镜下可见
贮积病
是由于遗传缺陷导致先天性缺乏某种溶酶体酶,结果与 酶相应的底物不能被消化而贮留在细胞内目前已知有40 多种先天性贮积病.多数是粘多糖和糖脂在组织中贮积
I型糖原累积病 是一种葡萄糖6-磷酸脂酶缺陷所引起的 代谢性疾病,主要病理变化是肝细胞内大量糖原颗粒堆积
第一节 酶细胞化学原理
一、酶反应特异性和酶的定位 二、酶细胞化学反应 三、酶和底物 四、捕捉反应
水解酶
四唑盐
底物
分解产物
蓝紫色色素
（吲哚酚）
一、金属盐沉淀法
酶+底物+捕捉剂
金属盐
捕 捉
酶+底物+Ca+捕捉剂
金属盐
酶+底物+捕捉底物还原+捕捉剂
(生理、捕捉 )
反 二、色素形成法
应 1 联苯胺(DAB)色素法和嗜锇物质法
的
酶+底物+DAB
棕黄色+锇酸
两
(光镜)
大
2偶氮色素法
ห้องสมุดไป่ตู้
类
酶+捕捉底物+重氮盐 色素
第二部分 细胞化学技术
cytochemistry
细胞化学技术是在保持细胞结构完整的条件下， 借助细胞中的化学反应在原位确定化学成分的分 布及这些成分在细胞活动中的动态变化的技术
细胞化学是组织化学和细胞化学的统称 （ 组织化学 强调光镜水平的应用） （ 细胞化学 强调在电镜水平的应用）
细胞化学技术包括： 酶细胞化学技术 免疫细胞化学技术 原位杂交技术 放射自显影技术等
（三）包埋和切片
光镜样品常规的石蜡包埋和切片可以满足相当一部分 酶的细胞化学要求
电镜酶细胞化学反应一般在未经包埋的组织片上进行
二、基本实验过程
光镜样品
固定（酶固定＋结构固定）→ 冷冻切片 → 细胞化学反应（酶反应＋捕捉反应） → 光镜观察
电镜样品
固定（酶固定＋结构固定）→ 切组织片 → 细胞化学反应（酶反应＋捕捉反应） → 脱水包埋 → 超薄切片 → 电镜观察
酶细胞化学反应过程
(1)
捕捉剂
酶＋底物 初级反应产物 最终反应产物
酶反应
捕捉反应
酶反应 相当于细胞内自然条件下发生的酶促反应 捕捉反应 为了使酶反应可见而人为造成
三、酶和底物 在生物化学中，酶被分成六大类:
水解酶 氧化还原酶 裂合酶 合成酶
转移酶 异构酶
通过特异底物来定位特异的酶,也有一种底物可被两种 或两种以上的酶作用,如ATP酶、腺苷酸环化酶都能作用 于底物ATP。为获得特异性的酶反应,采用以下方法:
＆ 使用酶抑制剂，把不希望发生的酶反应抑制掉 ＆ 寻找新的底物，避免其它酶的作用 ＆ 选择酶的最适pH ，避免其它酶的作用
四、捕捉反应
捕捉反应的设计思路是：
使酶反应产物形成在显微镜下可见的最终反应产物： 光镜--鲜明颜色 电镜--高电子密度
捕捉反应两种主要类型:
（一） 金属盐沉淀法 （二）色素形成法和嗜锇物质生成法
高尔基体 焦磷酸硫胺素酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶
溶酶体 酸性磷酸酶
微体
过氧化氢酶
线粒体 细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶
细胞膜 核糖核苷磷酸酶（ATP酶）、碱性磷酸酶
一些疾病由于缺乏某种酶而使细胞内某些物质不能 被消化，这些物质大量堆积在细胞内,使细胞和组织的正 常功能受到障碍。常见的如：贮积病、I-细胞病、矽肺等
H2O2 H2O
nDAB
氧化聚合反应
DAB 氧化聚合物(棕黄色)
锇 酸 锇黑（高电子密度）
２. 偶氮色素法※
§ 水解酶作用于捕捉底物萘酚衍生物，分解产物与重 氮盐偶联剂固红或固蓝结合形成红或蓝色色素
水解酶
固红或固蓝
底物
分解产物
红或蓝色素
（无色）
§ 水解酶作用于捕捉底物吲哚酚酯，分解产物吲哚酚 与四唑盐形成蓝紫色色素
（一） 金属盐沉淀法
金属盐沉淀法的原理是：将重金属作为捕捉剂，使酶 反应产物直接或间与之结合形成金属盐沉淀,在光镜下呈 现颜色在电镜下呈现高电子密度
常见的三种方法:
1.酶作用于底物，初级产物与捕捉剂形成金属盐沉淀
2.酶作用于底物，初级产物与反应液中的钙离子结合加 入重金属置换钙，再令重金属盐显色
3.酶作用于底物，底物之一为生理底物，在反应中被氧 化，底物之二为捕捉底物，在反应中被还原。被还原 的捕捉底物与加入的重金属捕捉剂形成金属盐沉淀
第二节 酶细胞化学方法
一、样品制备 二、基本实验过程 三、一些关键问题
第一节 酶细胞化学原理
一、酶反应的特异性和酶的定位
酶反应的特异性：酶反应的特异性是它的底物特异 性，即酶只作用于它特有的底物
酶的定位：酶存在的特定部位称为酶的定位
二、酶细胞化学反应
酶细胞化学的原理是：在一定条件下，使组织细胞 内的酶作用于其底物，再将酶反应的产物作为反应物质， 在酶的作用部位进行捕捉，形成显微镜下可见的最终反应 产物，从而间接地使酶可见，以证明酶在细胞和细胞器水 平的定位