抗体工程制药PPT课件
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PEG：相对分子质量和浓度越大，促融率越高。但其 黏度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的浓度为 40%-50%，相对分子质量以4000为佳
二甲基亚砜（DMSO）
13.11.2020
11
HAT培养基：用次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配 制。其中氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细 胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和脾细胞 在这种组织培养条件，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞 是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞 内有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞HGPRT正常，用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长
13.11.2020
5
单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的针对一 个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体
单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可 大量生产等特点
单克隆抗体在临床实践中用于疾病的诊断和治疗
13.11.2020
6
基因工程抗体：1984年报道人-鼠嵌合抗体，相继制备出改形 抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等诸多类型
特点：基本上消除了单克隆抗体的鼠源性（免疫原性），相 对分子质量为完整抗体分子的1/3-1/80，原来鼠源性单克隆抗 体的诸多生物学活性已消失，如激活补体、促进吞噬功能 （免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留 同抗原特异性结合的活性，即仅应用其导向作用，制备导向 药物用于肿瘤治疗
13.11.2020
体外免疫法在制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原 性极弱且能引起免疫抑制时使用。优点是所需抗原量少， 一般只需几个微克，免疫期短，仅4-5d，干扰因素少，已 成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定
13.11.2020
10
二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择
骨髓瘤细胞：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的 杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。如 SP2/0、P3.653细胞
克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的 整个培养过程
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法
13.11.2020
15
四、单克隆抗体的大量制备
制备方法主要有两种：体外培养法，可获得l0µg /ml的 抗体；动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体
目前多采用动物体内诱生法生产制备单克隆抗体：因 为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，所 以选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体
1975年kohler和Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤 技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody, McAb)
13.11.2020
3
抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋 巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白
13.11.2020
16
动物体内诱生法优点：操作简便，比较经济，所得单 克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细 胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株
动物体内诱生法缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多 种杂蛋白，给纯化带来难度
13.11.2020
17
五、单克隆抗体的纯化
根据Ig的类别和亚类的不同，选择不同的纯化方法 根据用途不同选择不同的纯化方法，如用于体外诊断
常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免 疫技术等
一般来说免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性 抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于 细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组 织标本为目的抗体时，免疫荧光法则更有意义
13.11.2020
14
筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞 或有多株分泌抗体的细胞，而且刚融合获得的杂交瘤 细胞不稳定，染色体易丢失，应尽早克隆化
重链（heavy chain, H链）：有450-570个氨基酸残基 轻链（light chain, L链）：约有214个氨基酸残基 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） 互补决定区（complementary determining region,CDR）
抗体制药
13.11.2020
1
一、概述
13.11.2020
2
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 建立血清疗法，开创了抗体制药
1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白和丙种(γ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分
7
二、单克隆抗体及其制备
13.11.2020
8wk.baidu.com
一、 抗原与动物免疫
用于免疫的抗原：多数情况下抗原物质是部分纯化或 极不纯的混合物
一般采用与骨髓瘤供体同一品系动物进行免疫： BALB/c 小鼠和Lou大鼠
免疫方法：体内免疫法（脾内免疫法）、体外免疫法
13.11.2020
9
体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般 用8-12周龄的雌性鼠
试剂，IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方 法，IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法； 若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、 病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴离 子交换层析处理
13.11.2020
18
三、基因工程抗体及其制备
13.11.2020
19
Ig分子结构
13.11.2020
12
饲养细胞：在最适宜培养条件下，大约105个脾细胞能 形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通 常要加入饲养细胞才能使其繁殖
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺 细胞等
13.11.2020
13
三、筛选阳性克隆与克隆化
免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）：将具有抗体活 性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白
所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性
13.11.2020
4
多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体 应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳性
结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断。精制单价血清仍然难免 出现假阳性结果；而且其产量很低，很难满足临床治 疗和诊断上的需要
二甲基亚砜（DMSO）
13.11.2020
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HAT培养基：用次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)配 制。其中氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细 胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞和脾细胞 在这种组织培养条件，几天内亦迅速死亡。由于骨髓瘤细胞 是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺乏株，脾细胞 内有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞HGPRT正常，用 次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长
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单克隆抗体：由单一的B淋巴细胞克隆产生的针对一 个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体
单克隆抗体具有高度特异性、均一性，有稳定来源可 大量生产等特点
单克隆抗体在临床实践中用于疾病的诊断和治疗
13.11.2020
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基因工程抗体：1984年报道人-鼠嵌合抗体，相继制备出改形 抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等诸多类型
特点：基本上消除了单克隆抗体的鼠源性（免疫原性），相 对分子质量为完整抗体分子的1/3-1/80，原来鼠源性单克隆抗 体的诸多生物学活性已消失，如激活补体、促进吞噬功能 （免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留 同抗原特异性结合的活性，即仅应用其导向作用，制备导向 药物用于肿瘤治疗
13.11.2020
体外免疫法在制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原 性极弱且能引起免疫抑制时使用。优点是所需抗原量少， 一般只需几个微克，免疫期短，仅4-5d，干扰因素少，已 成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的 杂交瘤细胞株不够稳定
13.11.2020
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二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择
骨髓瘤细胞：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的 杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。如 SP2/0、P3.653细胞
克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的 整个培养过程
常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法
13.11.2020
15
四、单克隆抗体的大量制备
制备方法主要有两种：体外培养法，可获得l0µg /ml的 抗体；动物体内诱生法，可获得5-20mg/ml的抗体
目前多采用动物体内诱生法生产制备单克隆抗体：因 为杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，所 以选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体
1975年kohler和Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤 技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibody, McAb)
13.11.2020
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抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋 巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成 和分泌的球蛋白
13.11.2020
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动物体内诱生法优点：操作简便，比较经济，所得单 克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细 胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株
动物体内诱生法缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多 种杂蛋白，给纯化带来难度
13.11.2020
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五、单克隆抗体的纯化
根据Ig的类别和亚类的不同，选择不同的纯化方法 根据用途不同选择不同的纯化方法，如用于体外诊断
常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免 疫技术等
一般来说免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性 抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于 细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组 织标本为目的抗体时，免疫荧光法则更有意义
13.11.2020
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筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞 或有多株分泌抗体的细胞，而且刚融合获得的杂交瘤 细胞不稳定，染色体易丢失，应尽早克隆化
重链（heavy chain, H链）：有450-570个氨基酸残基 轻链（light chain, L链）：约有214个氨基酸残基 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） 互补决定区（complementary determining region,CDR）
抗体制药
13.11.2020
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一、概述
13.11.2020
2
1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素， 建立血清疗法，开创了抗体制药
1937年Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、 甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白和丙种(γ）球 蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分
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二、单克隆抗体及其制备
13.11.2020
8wk.baidu.com
一、 抗原与动物免疫
用于免疫的抗原：多数情况下抗原物质是部分纯化或 极不纯的混合物
一般采用与骨髓瘤供体同一品系动物进行免疫： BALB/c 小鼠和Lou大鼠
免疫方法：体内免疫法（脾内免疫法）、体外免疫法
13.11.2020
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体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般 用8-12周龄的雌性鼠
试剂，IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方 法，IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法； 若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素、 病毒、核酸等微量的污染物，必须经亲和层析和阴离 子交换层析处理
13.11.2020
18
三、基因工程抗体及其制备
13.11.2020
19
Ig分子结构
13.11.2020
12
饲养细胞：在最适宜培养条件下，大约105个脾细胞能 形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相 继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通 常要加入饲养细胞才能使其繁殖
常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺 细胞等
13.11.2020
13
三、筛选阳性克隆与克隆化
免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）：将具有抗体活 性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白
所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性
13.11.2020
4
多克隆抗体：针对多种抗原决定簇的抗体 应用过程中经常发生非特异性交叉反应而出现假阳性
结果，必须经多次吸收试验才能得到所谓的精制单价 血清，用于临床病原学诊断。精制单价血清仍然难免 出现假阳性结果；而且其产量很低，很难满足临床治 疗和诊断上的需要