食品中嗜热菌芽孢的检测
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食品中嗜热菌芽孢的检测
1.微生物学的基本理论 2.嗜热微生物的介绍 3.嗜热菌的检测方法
微生物的概念
microorganism，Microbe来自法语microbe， 是指一切用肉眼看不见或看不清的微小生物 的总称。 微生物是所有形体微小、单细胞或结构较为 简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生 物的通称
1983年J.A.Barros等在太平洋底部发现的 可生长在250～300℃高温高压下的嗜热菌 更是生命的奇迹。
耐 热 菌 的 生 境
耐热机制（生物化学原理）
嗜热微生物对高温的适应机制主要表现在 1 细胞膜上脂肪酸的成分 2 耐高温酶 3 生物大分子的热稳定性上。 4 细胞壁 5 热休克蛋白的作用
嗜热微生物的概念
1.嗜热微生物(thermophilicmicroorganisms) 是在高温环境下生存的一类高适应微生物。 2.它们有其自己的适应机构和特定的新陈代谢 能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制 及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。
嗜热菌的最适生长温度65～70℃，40℃以下不 能生长。超嗜热菌又称之为嗜高温菌，其最适 生长温在80～110℃，最低生长温度在55℃左右。 大部分超嗜热菌是古生菌，但也有真细菌归属 此类。
源自文库
特征
个体微小，用肉眼难以直接观察，需用光学
显微镜（m）、电子显微镜（nm） 结构简单，都为单细胞、简单多细胞，或是 非细胞类 进化地位低，起源早，古生菌在地球形成后 的第一个十亿年中已经出现 ，可能是地球上 最古老的生命
个体小:
测量单位：微米或钠米
火 星 陨 石 中 发 现 的 细 菌 化 石 （ 直 径 20 nm
南极Vostok湖冰芯样品中的微生物
易变异
★突变频率一般为10-5～10-10，但因繁殖快， 数量多，与外界环境直接接触，因而在短 时间内可出现大量变异的后代。
（五）分布广，种类多
人迹可到之处，微生物的分布必然很多， 而人迹不到的地方，也有大量的微生物存在！
种类多 代谢产物种类多； 微生物的生理代谢类型多； 微生物的种数“多”；
人类(300万年)
爬行类(2亿年)
适应强
耐热、 耐寒（-196℃-300 ℃ ） 耐盐 耐酸、耐碱
两栖动物(3亿年)
耐压：
鱼类、陆生动物(4亿年)
后生动物(6亿年)
古细菌
蓝细菌 好氧性异养细菌
(20亿年)
真核微生物
(15亿年)
(35亿年) ( 32亿年)
南 极 冰 盖 下 的 微 生 物
嗜热芽孢杆菌，其细菌繁殖 体对培养基要求低，在溴甲 酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生 长良好，表面粗糙呈米黄色。 其最低生长温度为28℃，最 高生长温度70～77℃。最适 生长繁殖温度为56～65℃， 培养24h即可形成菌落， 37℃下24h看不到菌落，在 pH6.8～7.2的培养基中生长 良好。
实验方法
样品制备：
将20g样品放入
盛有适量玻璃珠 的250 mL灭菌三 角烧瓶内,加灭菌 蒸馏水至100mL 刻度线,振摇,制 成均匀的混悬液。
接种培养和计数
用大口径移液管 或移液枪移取10 mL面粉混悬液,在 搅拌状态下加入 盛有100mL融化的 葡萄糖胰蛋白胨 琼脂(55～60℃)的 250mL三角烧瓶内。
实验前准备 测定一个样品单次需要：
1个无菌的空250ml三角 烧瓶（装有适量玻璃珠）
1个装有100ml无菌培养 基的三角烧瓶 5个无菌培养皿 无菌水100ml 无菌琼脂
高压灭菌锅的注意事项
堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的 出气口 使用前必须确保锅内有足够的水，防 止干烧 在运行压力灭菌锅前，需确保容器盖 已完全密封 放气口上的橡胶管需插入装有冷水的 容器中 压力灭菌锅工作中，不得强行开启和 触摸容器盖 压力灭菌锅运行结束时，需待压力表 指示归零后方能打开容器盖
（二）吸收多，转化快
消耗自身重量2000倍食物的时间： 大肠杆菌：1小时 // 人：500年（按400斤/年计算 70公斤重的人每天进食5公斤，每小时吸收的量只 为自身重量的0.3% 乳酸菌每小时吸收的营养物质的重量为自身重量 的100多倍
意义
为微生物生长提供了充足的物质基础
（四） 适应强，易变异
因为嗜热菌可以在高温条件下进行繁殖， 在食品热加工过程中难以将其灭活，所 以食品生产检测中需要测定嗜热菌的菌 落总数
嗜热菌的检测方法
----采用国标SN/T 0178-2011
实验原理
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁 殖而形成的能被肉眼识别的生长物， 它是由数以万计相同的微生物集合而 成。
嗜热微生物的发现
高温环境：嗜热微生物生长的环境有热泉 (温度可达100℃)、草堆、厩肥、煤堆、 地热区土壤及海底火山附近等处。在美国 黄石国家公园的热泉中，热溶芽孔杆菌 (Bacillcu caLdolyticus)可在92～93℃(该 地水的沸点)下生长(实际上，在实验室条 件下该菌可在100～105℃下生长)。
将此混合物
在沸水或蒸 汽柜中放置 15 min。
轻微搅拌使尽快冷却,再将全部混合物等
量倾注至5个灭菌培养皿内。凝固后于其 表面覆盖一薄层2％灭菌琼脂
待覆盖琼脂凝固后,倒置培养皿于55℃保
持一定湿度培养48 h。
计数5个平板上的菌落
面粉： 5个平板上的菌落数相加,再乘以5即为 10g样品中的需氧嗜热芽孢总数，单位为 CFU/10g。
首先，这些生物中的酶和其他蛋白质比嗜温微 生物中的酶和蛋白质更具有耐热性，并且这些 大分子实际上只有在高温下才能起到最佳作用。 其原因可能是氨基酸序列不同，使酶以不同的 方式进行折叠，从而使此酶能耐受热变性作用。
嗜热菌细胞膜的稳定性也与其耐热机制有关。它的 细胞膜上长链饱和脂肪酸的比例随着温度的提高而 增多，相应的不饱和脂肪酸则减少，而饱和脂肪酸 比不饱和脂肪酸能生成更强的疏水链，这些疏水链 更有利于膜对高温的稳定性。此外，嗜热菌的tRNA 中G.C含量高，可提供较多的氢键，故具有独特的热 稳定性。
3、生长旺、繁殖快
4、适应强、易变异
5、分布广、种类多
（一） 体积小
面积大
意义
1 扩大了吸收面、排泄面、信息交换面 2 是将微生物作为群体研究的依据 3 启发人们利用动、植物的微化培养
个体小：微米、纳米 群体表面积大
表面积 4r 2 3 比面值 面积/体积=比面值 4 体积 r 3 r 3 6/1 600/1000
微生物类群 有细胞结构（细胞型） 代表物
原核类：细菌（真细菌、古
细菌），放线菌、蓝细菌、 支原体、立克次氏体、衣 原体
真核类：真菌（酵母菌、霉
菌）、原生动物、显微藻 类 无细胞结构（非细胞型） 非细胞类：病毒、亚病毒 （类病毒、拟病毒、阮病 毒）
微生物的五大共性
1、体积小、面积大
2、吸收多、转化快
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一 定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都 可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数是 指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如 培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等) 所取1ml(g)检样中所含菌落的总数。
嗜热芽孢杆菌在特定的时间中，经100℃或 106℃热处理后，能在指定的培养环境和非选择 性培养基中，55℃培养生长形成菌落的细菌芽 孢。包括需氧芽孢、厌氧芽孢，其中需氧芽孢包 括平酸菌芽孢，厌氧芽孢包括产硫化氢厌氧芽孢 和不产硫化氢厌氧芽孢。接种后的培养基通过沸 水热处理15分钟，能把非嗜热菌灭活，通过 55℃培养即可得到嗜热菌。
《科学》上的一篇文章报道了对一快活性陨石上可能存在的生命遗迹的 研究，这块陨石在45亿年前在火星上形成，13亿年以前由于宇宙碰撞而离开火 星，13000年前作为陨石降落到地球上。对它的分析表明其上可能有生命存在过 ，更重要的是在该陨石上发现了类似细菌化石的东西，其直径仅为20~40 nm.
微生物的主要类群
1.微生物学的基本理论 2.嗜热微生物的介绍 3.嗜热菌的检测方法
微生物的概念
microorganism，Microbe来自法语microbe， 是指一切用肉眼看不见或看不清的微小生物 的总称。 微生物是所有形体微小、单细胞或结构较为 简单的多细胞生物、甚至没有细胞结构的生 物的通称
1983年J.A.Barros等在太平洋底部发现的 可生长在250～300℃高温高压下的嗜热菌 更是生命的奇迹。
耐 热 菌 的 生 境
耐热机制（生物化学原理）
嗜热微生物对高温的适应机制主要表现在 1 细胞膜上脂肪酸的成分 2 耐高温酶 3 生物大分子的热稳定性上。 4 细胞壁 5 热休克蛋白的作用
嗜热微生物的概念
1.嗜热微生物(thermophilicmicroorganisms) 是在高温环境下生存的一类高适应微生物。 2.它们有其自己的适应机构和特定的新陈代谢 能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制 及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。
嗜热菌的最适生长温度65～70℃，40℃以下不 能生长。超嗜热菌又称之为嗜高温菌，其最适 生长温在80～110℃，最低生长温度在55℃左右。 大部分超嗜热菌是古生菌，但也有真细菌归属 此类。
源自文库
特征
个体微小，用肉眼难以直接观察，需用光学
显微镜（m）、电子显微镜（nm） 结构简单，都为单细胞、简单多细胞，或是 非细胞类 进化地位低，起源早，古生菌在地球形成后 的第一个十亿年中已经出现 ，可能是地球上 最古老的生命
个体小:
测量单位：微米或钠米
火 星 陨 石 中 发 现 的 细 菌 化 石 （ 直 径 20 nm
南极Vostok湖冰芯样品中的微生物
易变异
★突变频率一般为10-5～10-10，但因繁殖快， 数量多，与外界环境直接接触，因而在短 时间内可出现大量变异的后代。
（五）分布广，种类多
人迹可到之处，微生物的分布必然很多， 而人迹不到的地方，也有大量的微生物存在！
种类多 代谢产物种类多； 微生物的生理代谢类型多； 微生物的种数“多”；
人类(300万年)
爬行类(2亿年)
适应强
耐热、 耐寒（-196℃-300 ℃ ） 耐盐 耐酸、耐碱
两栖动物(3亿年)
耐压：
鱼类、陆生动物(4亿年)
后生动物(6亿年)
古细菌
蓝细菌 好氧性异养细菌
(20亿年)
真核微生物
(15亿年)
(35亿年) ( 32亿年)
南 极 冰 盖 下 的 微 生 物
嗜热芽孢杆菌，其细菌繁殖 体对培养基要求低，在溴甲 酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生 长良好，表面粗糙呈米黄色。 其最低生长温度为28℃，最 高生长温度70～77℃。最适 生长繁殖温度为56～65℃， 培养24h即可形成菌落， 37℃下24h看不到菌落，在 pH6.8～7.2的培养基中生长 良好。
实验方法
样品制备：
将20g样品放入
盛有适量玻璃珠 的250 mL灭菌三 角烧瓶内,加灭菌 蒸馏水至100mL 刻度线,振摇,制 成均匀的混悬液。
接种培养和计数
用大口径移液管 或移液枪移取10 mL面粉混悬液,在 搅拌状态下加入 盛有100mL融化的 葡萄糖胰蛋白胨 琼脂(55～60℃)的 250mL三角烧瓶内。
实验前准备 测定一个样品单次需要：
1个无菌的空250ml三角 烧瓶（装有适量玻璃珠）
1个装有100ml无菌培养 基的三角烧瓶 5个无菌培养皿 无菌水100ml 无菌琼脂
高压灭菌锅的注意事项
堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的 出气口 使用前必须确保锅内有足够的水，防 止干烧 在运行压力灭菌锅前，需确保容器盖 已完全密封 放气口上的橡胶管需插入装有冷水的 容器中 压力灭菌锅工作中，不得强行开启和 触摸容器盖 压力灭菌锅运行结束时，需待压力表 指示归零后方能打开容器盖
（二）吸收多，转化快
消耗自身重量2000倍食物的时间： 大肠杆菌：1小时 // 人：500年（按400斤/年计算 70公斤重的人每天进食5公斤，每小时吸收的量只 为自身重量的0.3% 乳酸菌每小时吸收的营养物质的重量为自身重量 的100多倍
意义
为微生物生长提供了充足的物质基础
（四） 适应强，易变异
因为嗜热菌可以在高温条件下进行繁殖， 在食品热加工过程中难以将其灭活，所 以食品生产检测中需要测定嗜热菌的菌 落总数
嗜热菌的检测方法
----采用国标SN/T 0178-2011
实验原理
菌落是指细菌在固体培养基上生长繁 殖而形成的能被肉眼识别的生长物， 它是由数以万计相同的微生物集合而 成。
嗜热微生物的发现
高温环境：嗜热微生物生长的环境有热泉 (温度可达100℃)、草堆、厩肥、煤堆、 地热区土壤及海底火山附近等处。在美国 黄石国家公园的热泉中，热溶芽孔杆菌 (Bacillcu caLdolyticus)可在92～93℃(该 地水的沸点)下生长(实际上，在实验室条 件下该菌可在100～105℃下生长)。
将此混合物
在沸水或蒸 汽柜中放置 15 min。
轻微搅拌使尽快冷却,再将全部混合物等
量倾注至5个灭菌培养皿内。凝固后于其 表面覆盖一薄层2％灭菌琼脂
待覆盖琼脂凝固后,倒置培养皿于55℃保
持一定湿度培养48 h。
计数5个平板上的菌落
面粉： 5个平板上的菌落数相加,再乘以5即为 10g样品中的需氧嗜热芽孢总数，单位为 CFU/10g。
首先，这些生物中的酶和其他蛋白质比嗜温微 生物中的酶和蛋白质更具有耐热性，并且这些 大分子实际上只有在高温下才能起到最佳作用。 其原因可能是氨基酸序列不同，使酶以不同的 方式进行折叠，从而使此酶能耐受热变性作用。
嗜热菌细胞膜的稳定性也与其耐热机制有关。它的 细胞膜上长链饱和脂肪酸的比例随着温度的提高而 增多，相应的不饱和脂肪酸则减少，而饱和脂肪酸 比不饱和脂肪酸能生成更强的疏水链，这些疏水链 更有利于膜对高温的稳定性。此外，嗜热菌的tRNA 中G.C含量高，可提供较多的氢键，故具有独特的热 稳定性。
3、生长旺、繁殖快
4、适应强、易变异
5、分布广、种类多
（一） 体积小
面积大
意义
1 扩大了吸收面、排泄面、信息交换面 2 是将微生物作为群体研究的依据 3 启发人们利用动、植物的微化培养
个体小：微米、纳米 群体表面积大
表面积 4r 2 3 比面值 面积/体积=比面值 4 体积 r 3 r 3 6/1 600/1000
微生物类群 有细胞结构（细胞型） 代表物
原核类：细菌（真细菌、古
细菌），放线菌、蓝细菌、 支原体、立克次氏体、衣 原体
真核类：真菌（酵母菌、霉
菌）、原生动物、显微藻 类 无细胞结构（非细胞型） 非细胞类：病毒、亚病毒 （类病毒、拟病毒、阮病 毒）
微生物的五大共性
1、体积小、面积大
2、吸收多、转化快
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一 定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都 可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数是 指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如 培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等) 所取1ml(g)检样中所含菌落的总数。
嗜热芽孢杆菌在特定的时间中，经100℃或 106℃热处理后，能在指定的培养环境和非选择 性培养基中，55℃培养生长形成菌落的细菌芽 孢。包括需氧芽孢、厌氧芽孢，其中需氧芽孢包 括平酸菌芽孢，厌氧芽孢包括产硫化氢厌氧芽孢 和不产硫化氢厌氧芽孢。接种后的培养基通过沸 水热处理15分钟，能把非嗜热菌灭活，通过 55℃培养即可得到嗜热菌。
《科学》上的一篇文章报道了对一快活性陨石上可能存在的生命遗迹的 研究，这块陨石在45亿年前在火星上形成，13亿年以前由于宇宙碰撞而离开火 星，13000年前作为陨石降落到地球上。对它的分析表明其上可能有生命存在过 ，更重要的是在该陨石上发现了类似细菌化石的东西，其直径仅为20~40 nm.
微生物的主要类群