放射免疫分析技术
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• 乳过氧化酶法： • Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应
时间长
• 置换法： 3H 最常用
c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析
或 HPLC 分离
d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法
• 最大结合百分率 • 标准曲线比较法
e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），
层析纯化
• d. 抗体的鉴定
•
鉴定内容：效价、亲和力、特异性
•
鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA
• e. 单克隆抗体的使用：
•
用于 IRMA 或 RIA，特异性高
•
不一定优于传统的多克隆抗体
5. 竞争性放射免疫分析法的建立
• （1）反应方式 • a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育 • b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入
酶免疫
• 检测方法 • 生化、常规免疫 • 荧光免疫、酶免疫 • 放射免疫、发光免疫 • PCR
检测范围 mg~μg（10-3 ~10-6 g） μg~ng（10-6 ~10-9 g） ng~pg（10-9 ~10-12 g） pg~fg（10-12 ~10-15 g）
一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay， RIA）
放射免疫分析技术
（Radioimmunoassay，RIA）
核医学
• 治疗：肿瘤、甲亢等
• 诊断 •
•
体内——PET、SPECT、 放射免疫成像等
体外——放射免疫分析（RIA）
标记免疫分析技术
•
用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的
分析方法
• 特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果
• 三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、
小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结好，但非特异性高
•
二抗-PEG 法：较好，现常用
•
磁化颗粒法：
•
固相法：现较常用
（4）添加剂的问题
• a. 防腐剂：低浓度 NaN3 对分析的影响小 • b. 抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响 • c. 抑肽酶：对一般分析无影响
6. 放射免疫分析的数据处理
• （1）数据处理的基本步骤 • a. 作图法 • b. 数学模型法 • （2）几种数学模型 • a. 一般多项式函数：普适性差，现基本不用 • b. 直线法：logit-lg 转换 • c. 四参数 Logistic 模型：目前常用
• （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年
• 3. 测量仪器
• （1）γ 计数仪
• （2）β 液闪仪
4. 基本试剂
• （1）标准品与质控品
• a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据
• b. 要求：
•
化学结构上——与待测物有相同的化学结构
•
化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低
•
稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定
• b. 抗体的制备
•
选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊
•
应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +
卡介苗）
•
选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊
柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数
c. 抗体的纯化
• 去除杂抗体：用抗原吸附法
• 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和
标记抗原。可提高反应灵敏度
• c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件 • （2）反应体系 • a. 缓冲液：常用 0.05~0.1 mol/L pH 7.4~7.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲
液。根据需要定
• b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差 • c. 反应时间： • d. 反应温度： • e. 反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体
7. 放射免疫分析的质量控制
• （1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因
• a. 系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差
•
试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的
影响
•
仪器误差：测量仪器不准；加样器不准
•
分离误差：分离不完全或失误
•
数据处理误差：选用数学模型不当
• b. 随机误差：偶然因素造成的误差
再对载体作标记
（3）特异性结合抗体
• a. 对特异性结合抗体的要求：
•
亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结
合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度
•
特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的
结合能力（交叉反应）低
•
滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高
•
女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末
• 发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖
• 1. 基本原理
• （1）竞争结合分析：Ag + Ab AgAb
•
*Ag + Ab *AgAb
• （2）IRMA（免疫放射分析）：
• 2. 常用标记核素：
• （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天
•
含量准确
•
注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期
• c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准
（2）标记物
• a. 对标记物的要求
•
比活度高：即单位物质的放射性强度高
•
生物活性及免疫活性与标记前改变小
•
放射化学纯度高：应 > 95%
•
稳定性好：标记的同位素不易脱落
b. 标记方法：
氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法 简便，但易造成蛋白质的损伤
•
同位素计数的统计涨落
（2）放射免疫分析的质量控制指标
• a. 精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（SD）、
变异系数（CV）、精密度图（PDP）表示
• b. 准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以
偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价
• c. 灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最
与标记的用量可扩大测定范围
（3）分离方法
• a. 对分离方法的要求：
•
使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全
•
分离后便于放射性测量
•
分离效果不受外界干扰因素的影响
•
操作简便、分离迅速、重复性好
•
与游离标记物的非特异性结合尽可能小
•
试剂来源广泛、价格低廉
• b. 常用的分离方法
•
二抗法：非特异性低，但沉淀较差
时间长
• 置换法： 3H 最常用
c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析
或 HPLC 分离
d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法
• 最大结合百分率 • 标准曲线比较法
e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），
层析纯化
• d. 抗体的鉴定
•
鉴定内容：效价、亲和力、特异性
•
鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA
• e. 单克隆抗体的使用：
•
用于 IRMA 或 RIA，特异性高
•
不一定优于传统的多克隆抗体
5. 竞争性放射免疫分析法的建立
• （1）反应方式 • a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育 • b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入
酶免疫
• 检测方法 • 生化、常规免疫 • 荧光免疫、酶免疫 • 放射免疫、发光免疫 • PCR
检测范围 mg~μg（10-3 ~10-6 g） μg~ng（10-6 ~10-9 g） ng~pg（10-9 ~10-12 g） pg~fg（10-12 ~10-15 g）
一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay， RIA）
放射免疫分析技术
（Radioimmunoassay，RIA）
核医学
• 治疗：肿瘤、甲亢等
• 诊断 •
•
体内——PET、SPECT、 放射免疫成像等
体外——放射免疫分析（RIA）
标记免疫分析技术
•
用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的
分析方法
• 特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果
• 三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、
小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结好，但非特异性高
•
二抗-PEG 法：较好，现常用
•
磁化颗粒法：
•
固相法：现较常用
（4）添加剂的问题
• a. 防腐剂：低浓度 NaN3 对分析的影响小 • b. 抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响 • c. 抑肽酶：对一般分析无影响
6. 放射免疫分析的数据处理
• （1）数据处理的基本步骤 • a. 作图法 • b. 数学模型法 • （2）几种数学模型 • a. 一般多项式函数：普适性差，现基本不用 • b. 直线法：logit-lg 转换 • c. 四参数 Logistic 模型：目前常用
• （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年
• 3. 测量仪器
• （1）γ 计数仪
• （2）β 液闪仪
4. 基本试剂
• （1）标准品与质控品
• a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据
• b. 要求：
•
化学结构上——与待测物有相同的化学结构
•
化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低
•
稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定
• b. 抗体的制备
•
选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊
•
应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +
卡介苗）
•
选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊
柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数
c. 抗体的纯化
• 去除杂抗体：用抗原吸附法
• 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和
标记抗原。可提高反应灵敏度
• c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件 • （2）反应体系 • a. 缓冲液：常用 0.05~0.1 mol/L pH 7.4~7.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲
液。根据需要定
• b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差 • c. 反应时间： • d. 反应温度： • e. 反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体
7. 放射免疫分析的质量控制
• （1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因
• a. 系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差
•
试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的
影响
•
仪器误差：测量仪器不准；加样器不准
•
分离误差：分离不完全或失误
•
数据处理误差：选用数学模型不当
• b. 随机误差：偶然因素造成的误差
再对载体作标记
（3）特异性结合抗体
• a. 对特异性结合抗体的要求：
•
亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结
合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度
•
特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的
结合能力（交叉反应）低
•
滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高
•
女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末
• 发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖
• 1. 基本原理
• （1）竞争结合分析：Ag + Ab AgAb
•
*Ag + Ab *AgAb
• （2）IRMA（免疫放射分析）：
• 2. 常用标记核素：
• （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天
•
含量准确
•
注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期
• c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准
（2）标记物
• a. 对标记物的要求
•
比活度高：即单位物质的放射性强度高
•
生物活性及免疫活性与标记前改变小
•
放射化学纯度高：应 > 95%
•
稳定性好：标记的同位素不易脱落
b. 标记方法：
氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法 简便，但易造成蛋白质的损伤
•
同位素计数的统计涨落
（2）放射免疫分析的质量控制指标
• a. 精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（SD）、
变异系数（CV）、精密度图（PDP）表示
• b. 准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以
偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价
• c. 灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最
与标记的用量可扩大测定范围
（3）分离方法
• a. 对分离方法的要求：
•
使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全
•
分离后便于放射性测量
•
分离效果不受外界干扰因素的影响
•
操作简便、分离迅速、重复性好
•
与游离标记物的非特异性结合尽可能小
•
试剂来源广泛、价格低廉
• b. 常用的分离方法
•
二抗法：非特异性低，但沉淀较差