严格厌氧菌菌种保藏方法

严格厌氧菌菌种保藏方法

以下为本实验严格厌氧细菌的保藏方法，如果是兼性厌氧菌可参照好氧菌保藏方法保藏。

一、厌氧细菌的甘油保藏方法：

1、厌氧甘油的制备：厌氧瓶或厌氧管中放置一定量的甘油，甘油的量根据需要加入，不

要多加，因为厌氧甘油制备好以后不能反复灭菌，反复灭菌甘油会变性而呈黄色，且有一股芳香味道。加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。往厌氧瓶中通N2，通气时间和配制培养基时时间相同。盖上塞子和盖子。121 ℃，20 min 灭菌后备用。

2、取新鲜菌液（对数期），在通N2的情况下，用针筒和针头往有菌液的厌氧管中加入终

浓度为15-20 %的厌氧甘油，再通一会N2，目的是赶走在转移甘油过程中带进去的O2。

盖上塞子和盖子，混匀，冻于-80℃。

3、活化：用针头和针头吸取一定甘油保藏的菌液，加到培养基当中，加的量一般要多于1 %，

因为厌氧菌的生物量比较小，一般2到5 %左右。目测加完甘油菌液的培养基是否浑浊，并作记录。如果加入的菌液太多，造成一开始培养基就比较浑浊，会干扰我们对菌是否生长的判断，而且甘油太多也会抑制菌的生长。

二、厌氧细菌的冷冻干燥保藏方法：

1、厌氧牛奶的制备：先配置10 % Difco Skim Milk（BD）的母液。和厌氧甘油配制方法一样，转移到厌氧瓶中，加入加入终浓度为0.04 %的L-cysteine和 1 %的5 %的N2S母液。通N2，盖上塞子和盖子。113℃，15 min 灭菌后放置过夜，于4℃放置备用。放置过夜后牛奶不结块，溶液均匀，不沉淀才可以用，否则牛奶变性，需要重新配制。同样，厌氧牛

奶只能灭菌一次，反复灭菌牛奶会变性。

2、准备冷冻干燥用的安瓿管，管口要用棉花封住，棉花缠在牙签上，这样拔出比较方便，灭菌并烘干后备用。

3、新鲜菌液离心，尽量除去上清，根据菌量加入10 % 的厌氧牛奶，一般大拇指盖大小的菌体能做15-20支安瓿管左右。将菌体打散后，迅速分装到安瓿管中，每支安瓿管0.2 ml，并用棉花封住管口，防止杂菌污染。

4、将分装好菌液的安瓿管竖直放置，可以用橡皮筋扎成捆，4℃冰箱预冷30 min；然后-20 ℃预冷1 hour；-80 ℃预冷2 hours；最后放入真空干燥机，-80 ℃冷冻干燥过夜。冻干后菌体和牛奶混在一起，呈粉末状。

5、抽真空，封口，标记。封口后的安瓿管内呈真空状态，可在4 ℃保存。

6、活化：用镊子夹住安瓿管底部，另一端用酒精灯外焰灼烧30 Sec，在灼烧部位滴几滴水，玻璃会因突然受冷而出现裂痕。用另一支镊子敲打裂痕部位至玻璃破裂。迅速向安瓿管中通入N2，吸取0.5ml的培养基注入管中，轻轻搅动几下并放置1-2 min，待粉末溶解后，2-5% 接种量接入到培养基中。注意：培养基可能会因为牛奶变浑浊，要做好观察和记录，以判断菌株是否长出。