细胞化学染色最新版本

5
（2）显色：通过不同的化学反应，最终形成稳定的有 色沉淀，使被监测的化学物质显示出来。包括 偶氮偶联法：如NAP、ACP及各种脂酶染色 普鲁氏蓝反应：如铁染色 雪夫（shiff）反应：如PAS染色 联苯胺法：如POX染色 （3）复染：使各种目的细胞能显示出来更便于观察
精品课件
6
二、细胞化学染色的基本方法
目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE 和α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）+ NaF抑制试验。
精品课件
特异性酯酶(CE)染色
1.原理（偶氮偶联法）
NAS-DCE
氯乙酸AS－D萘酚
基质液
+
基质液
)
AS－D萘酚不 物溶定位性于有胞色沉浆内淀 酶所在位
重氮盐(坚固蓝B盐
精品课件
34
2.试剂：
精品课件
52
5.结果观察
阳性：细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或 块状，胞核染绿色。 阴性：胞浆无色或无红色颗粒。
精品课件
53
6.临床意义
正常血细胞的染色反应 （1）粒系：原始细胞多为阴性，随着细胞成
熟，阳性逐渐增强。 （2）淋系：正常人阳性率10-50%之间，多为
20%以下。 （3）红系：PAS呈阴性反应 （4）巨核：PAS呈阳性反应 （5）单核系:呈阴性或细颗粒状弱阳性。
精品课件
61
2.试剂 （1）固定液：甲醇 （2）酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5 份，浓盐酸1份。取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管 中，缓慢加入浓盐酸，边滴边摇由开始的白色沉淀 消失为至。 （3）复染剂：0.5%沙黄
细胞化学染色检验
申家辉
精品课件
1
一、概述 二、细胞化学染色的基本方法 三、临床应用
精品课件
2
一、概 述
1、概念： 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门
科学，以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原 理对血细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、蛋 白质、糖类、铁、核酸等）作定性、定位、半定量分 析的方法。
精品课件
急性淋巴细胞白血病的POX染色
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性
精品课件
急性早幼粒细胞白血病的POX染色 １.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性
精品课件
急性单核细胞白血病的POX染色 1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；
3.原始单核细胞精品，课呈件 弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性
疾病鉴别 （1）红细胞系统疾病：M6、MDS呈阳性（均匀或块状红色） ；巨幼贫、再障呈阴性。 （2）白血病： 急淋及慢淋：粗颗粒或块状阳性 急粒：阴性或弱阳性（弥散细颗粒） 急单：阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒 急性巨核细胞白血病：阳性（块状）
Baidu Nhomakorabea
精品课件
56
PAS
AML-M6 幼红细胞呈阳性反
应
MA 幼红细胞呈阴
精品课件
38
CE精品课件
39
NAE）
非特异性酯酶染色（α-
1. 原理：
α-NAE
α-醋酸萘酚
7.4~7.6
形α成-萘不酚溶性有色沉淀
定位于胞浆内酶所在
位置
重氮盐
(坚固盐B)
精品课件
40
2.试剂
（1）固定液：甲醛
（2）作用液:
α-醋酸萘酚 丙酮 磷酸盐缓冲液 固蓝B盐
5mg 5-8ml 10ml 10mg
精品课件
9
3、染色方法 1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴，覆盖整
个髓膜，固定1-2min。 2、再加等量的稀H2O2，混匀后染色4－5min,勿倒去
染液直接流水冲洗。 3、瑞氏染液复染。
精品课件
10
4、注意事项 （1）H2O2要新鲜配制，注意有效性 （2）标本要新鲜，最长不超过一周，时间长了酶活性 减弱。 （3）POX染色后，一定要冲洗干净，否则染料堆积或 浮于表面，影响瑞氏染色结果观察。
精品课件
31
（三）酯酶染色
概述 特异性酯酶染色 非特异性酯酶染色
精品课件
概 述
根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性 酯酶(SE)和非特异性酯酶(NSE)；特异性酯酶是指氯 乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特异性酯酶根据 水解基质液的PH不同，又分为中性NSE（α-醋酸萘 酚酯酶 ），酸性NSE（酸性α-醋酸萘酚酯酶），碱 性NSE（α-丁酸萘酚酯酶）。
20
（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色
1.原理
（偶氮偶联法）
NAP
磷酸奈酚钠
磷酸+萘酚
PH9.2～9.8
偶联 萘酚+重氮盐
(坚固蓝RR盐)
不溶性有色沉淀物定位于胞浆
精品课件
21
2.试剂
（1）固定剂：10％甲醛甲醇溶液
（2）Tris-Hcl缓冲液的配制：Tris粉〔三胺基甲
烷〕4.85克溶于200ml蒸馏水中,加浓HCL1-2滴，PH调
使无色亚硫酸品红
恢复品红的红色
定位于含有糖原的细胞内
精品课件
48
2.试剂
（1）10g/L的过碘酸氧化剂 ⑵ 雪夫氏试剂（schiff）：红色品红 与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红。 ⑶ 20/L甲基绿复染液
精品课件
49
3.操作 （1）新鲜髓片放在95％乙醇中固定10分
钟；蒸馏水冲洗待干； （2）10g/L过碘酸氧化15分钟；蒸馏水冲洗； （3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干
至9.2，4℃保存！
（3）作用(基质液): 磷酸萘酚钠
5mg
N-N二甲基酰胺 1ml
Tris-Hcl液
4ml
坚固蓝RR盐
5mg
（4）复染液：1%中性红
精品课件
22
3.操作步骤 1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及对 照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干； 2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干； 3、1%中性红复染1min
； （4）甲基绿复染15分钟 ，水洗待干镜检。
精品课件
50
4.注意事项 （1）所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。
（2）雪夫氏染液应避光密封保存，变红则失效。 （3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片， 而且一定要完全干燥，若有水，试剂变色失效。
精品课件
51
（4）染色时间和温度应相对恒定，一般37℃效果最好 。 （5）染好的标本不能久放，8天后渐退色，因此应及 时观察。
精品课件
11
5、结果判定：中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳 性是染色成功的标志(设对照片）。 在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性 反应。
精品课件
12
1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈 阴性；3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性
精品课件
精品课件
14
急性粒细胞白血病（M2a) 的POX染色 原始粒细胞均呈阳性
精品课件
3
2.细胞化学染色的目的 （1）辅助判断急性白血病的类型 （2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断
精品课件
3.细胞化学染色的基本步骤：包括固定、显色反应、 复染。 （1）固定：为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而 选用的方法。根据染色的目的，最常用的固定剂有甲 醛、甲醇、乙醇等。
精品课件
过氧化物酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 糖原染色 非特异性酯酶染色 特异性酯酶染色 骨髓铁染色
精品课件
7
（一)过氧化物酶(POX)染色
1、原理：
pox
H2O2
O
联苯胺 +
联苯胺蓝
蓝黑色颗粒
亚硝基铁氰化钠
精品课件
8
2.试剂 (1)联苯胺酒精溶液： 取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml, 再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。 (2) 稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加 30%H2O21滴。 （3）瑞吉氏复染液
（1）固定液：10％甲醛甲醇溶液
（2）作用液（基质液）
氯乙酸AS－D萘酚 5mg
丙酮
5-8ml
磷酸盐缓冲液 19ml
坚固蓝B盐
10mg
（3）复染液：1%中性红
精品课件
35
3.染色方法
（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干 （2）滴加作用液37℃孵育30min，水洗 （3）1%中性红复染1min，水洗晾干镜检。
6、临床意义 （1）正常分布
粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不 同程度阳性。
单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。
淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。
精品课件
19
（2）急性白血病的鉴别诊断 幼稚细胞POX阳性率≥3% ：急非淋（AML) 幼稚细胞POX阳性率＜3% ：急淋（ALL)
精品课件
精品课件
46
骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显 示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色 的NAE阳性反应。
精品课件
（四）糖 原 染 色(PAS)
1.原理（过碘酸-雪夫氏反应）
细胞内糖原中的乙二醇基 氧化
过碘酸
二醛基
二醛基经过加成和缩合 失去亚硫酸
精品课件
42
A图：急性单核细胞白血病α-NAE染色 原始、幼稚单核细胞多呈强阳性
A
B图：急性单核细胞白血病 α-NAE氟化钠抑制染色
原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制 （与A图为同一标本）
精品课件
B
4.结果判断：胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性 染色成功指标：正常部分原始、幼稚及成熟单核细 胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟淋巴 或个别中、晚幼红呈阳性。
性反应
精品课件
急性淋巴细胞白血病PAS染色 原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性
精品课件
急淋PAS阳性细胞
精品课件
59
PAS阳性的幼红细胞
精品课件
60
（六）骨髓铁染色
1.原理(普鲁氏蓝反应)
4Fe3+ + K4[Fe(CN)6]稀盐酸
Fe4[Fe(CN)6]3 +12K+ 细胞外铁：主(要亚存铁在氰于化骨钾髓) 小粒的巨噬细胞中 (蓝 细色胞亚内铁铁氰：化主铁要) 存在于有核红细胞中
（3）复染液：10g/L甲基绿水溶液
精品课件
41
3.染色步骤 （1）甲醛蒸气固定5-10min，流水冲洗5min晾干
（2）放入作用液37℃1h,流水冲洗。
（3）10g/L的甲基绿溶液复染5min,水洗待干镜检 （4）NaF抑制试验：在40ml作用液中加NaF15mg同样 染色后，油镜计数100个被检细胞，分别计算出抑制前 和抑制后的阳性率和积分，按公式计算出抑制率，正常 小于50%。
精品课件
23
4.注意事项 (1) 重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；
(2) 坚固蓝RR盐应适量：过多易造成染色失败，过 少使反应减弱；
(3) 每次都要做阳性对照； (4) 作用液新鲜配制，配好后要立即使用
精品课件
24
5.结果观察:(对照片成熟中性粒细胞中出现棕
黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功) 正常人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外，其它 血细胞均为阴性。且正常阳性率＜40%，积分值 30～130分。
精品课件
36
4. 注意事项：
1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4℃冰箱 保存，变黄或混浊即失效。 2.染色温度37℃效果最好
精品课件
37
5.结果判断
中性分叶核粒细胞胞浆中见细小，弥漫分布的蓝 色颗粒为染色成功的标志。 6.临床意义
粒系除早期原粒外，其余阶段细胞均为阳性，其 它各系均为阴性。CE染色对粒细胞白血病有特异性 的诊断价值。
精品课件
54
正常血细胞PAS染色 1.原始粒细胞（-） 2.早幼粒细胞（+） 3.中性中幼粒细胞（++） 4.中性晚幼粒细胞（+++）5.中性杆状核粒细胞（++++） 6.中性分叶核粒细胞（++++）
7.嗜碱性粒细胞（+++）8.嗜酸性粒细胞（+++） 9.单核细胞（±） 精品课1件0.淋巴细胞（++++）
4.中性成熟精粒品课细件胞（++++）；5.淋巴细胞 （-）
精品课件
28
N精A品课P件分级
29
7.临床意义
增高：细菌感染、类白、AA、急淋、 慢粒急变、骨髓增殖性疾病，恶性淋巴瘤。
降低：慢粒、急粒、PNH、MDS、恶组
精品课件
30
8.鉴别诊断
慢粒与类白：前↓；后↑。 PNH与AA：前↓；后↑。 急粒与急淋：前↓；后↑。 MDS与慢性再障：前↓；后↑。 病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者↑。 恶组与反应性组织细胞增多：前↓；后↑。
精品课件
25
6.NAP阳性结果及积分判断标准
“－” 0分，胞浆中无阳性颗粒 “+” 1分，胞浆中含有少量颗粒 “2+” 2分，胞浆中含有中等量颗粒 “3+” 3分，胞浆中含有丰富的颗粒，但胞
核清楚 “4+” 4分，胞浆中含有丰富粗大的颗粒，
但胞核不清楚
精品课件
中性粒细胞碱性磷酸酶染色 1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（++）；3.中性成熟粒细胞（+++）；
精品课件
44
精品课件
45
5.临床意义：鉴别急性白血病 （1）急单时，原始至成熟单核大多为α-NAE阳性， 且易被NaF抑制，抑制率正常大于50%。 （2）急粒时，白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M3呈 阳性，但均不被NaF抑制。
酯酶双染：同一张血涂片上的细胞分别在两种不同 的基质液中作用一定时间，复染镜检。主用于鉴别诊 断AML-M4亚型。