细菌分离培养及药敏试验方法及步骤

细菌分离培养方法及操作步骤

无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。

平板划线接种法

这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作：

1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；

图1 病料采集图2 接种环灭菌

2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。

3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。）

图3 平板划线接种法

4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。

注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。

细菌药敏试验方法操作步骤

药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。

1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。

图4 接种环划线

2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

3、添加药物：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

图5 添加药物

药敏试验结果：

图6 药敏试验结果

影响药敏结果的因素：

1、培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时,厚度合适，约56mm，不可太薄,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基1820m为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质,如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性,胞腺密啶核苷和对氨苯甲酸(PABA)能拮抗磷胺药和TMP的活性

2、细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3、药物浓度:药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果,需精硫配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4、培养时间:一般培养温度和时间为37℃8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃泳箱内2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。温培养箱中培养18-24h后备用。

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