定点诱变技术

第三章DNA突变技术

基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。

根据其特点可将基因突变技术分两大类：

1.位点特异性突变定点突变

2.随机突变表型筛选

随机突变

易错PCR法(Error-prone PCR)

降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP

缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+

DNA Shuffling

外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法

交错延伸法

定点突变

点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube

Random fragmentation of a pool of related genes;

Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers);

PCR amplification with primers of reassembled products

How DNA shuffling works

Similar mutants generated by

error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras

Generating chimeras with crossovers of large blocks

of sequences

一、单基因和基因家族的重组装

X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX

XX X

X XX X

XXX X XX X

XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best

with DNAseI fragments recombinants

Repeat for multiple cycles

一、单基因和基因家族的重组装

D N A 重组装的过程

（Jae Kwang Song等，2000）

β-葡糖苷酶耐热性的提高

(Marý´a Jesu ´s Arrizubieta 等，2000）

耐热p-硝基苯酯酶的分子进化

(Lori Giver 等，1998）

The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573)are shown in red. Two

mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908)are

shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on

the protein surface (Val9 and Gln135)are shown in green. The rest of

the substrate binding and active site residues are shown in yellow..

牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HU ZHANG等，1997）

How DNA shuffling works？

二、随机引物PCR(RPR)和重组装

（Hikaru Suenaga等,2001）

How DNA shuffling works？

三、交错延伸PCR突变法(StEP)

枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）

进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系

正面

反面

进化后的枯草杆菌蛋白酶E

芽孢杆菌脲酸酶的定向进化（Su-Hua Huang等,2004）

定点突变的研究意义

1.对调控区进行突变

研究基因结构与功能之间的关系

2. 对编码基因进行突变

检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用

获得突变蛋白

定点突变的类型

▪寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA 分子进行复制。

▪盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。▪PCR介导的基因突变

DNA定点突变的种类 寡聚核苷酸介导替换、插入、删除

盒式突变

PCR介导

寡聚核苷酸介导法

在dut+的E. coli中

dUTP酶

dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut-）

dUTP dUMP

dut：dUTPase突变，可导致E. coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。