实验三 微生物染色观察

3.换片：另换新片，必须从第1条开始操作。 4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去
镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去 残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将 镜体全部复原。 注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头
用油镜观察细菌三形永久装片。
二 细菌的简单染色
实验原理
简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的 一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的 观察。
3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去 镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二甲 苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用一 小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
三 革兰氏染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 荚膜染色法等。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性 复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌 所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红 等酸性染料染色。
实验材料 1、菌种
枯草芽孢杆菌1D培养物
2、染色剂 吕氏碱性美蓝染液 齐氏石碳酸复红染液
四、实验步骤
涂片 干燥
无菌操作
水洗
固定
干燥
4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座， 不可单手拿，更不可倾斜拿。
5.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉 菌而腐蚀镜片。
操作步骤
现场演示
1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍 观察
2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，在标本中 央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调 至看清物象为止。
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、 碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷， 而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正 电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌 结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景 形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
实验原理 (continued)
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌 体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察 到其形态和结构。
革兰氏染色液一套
实验步骤
革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢染色 绘图、写实验报告
革兰氏染色的步骤
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸
铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲 去残水，而后用其覆盖涂面1分 钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约15－20秒，后立 即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染3－ 5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态
4、染色
操作步骤（continued）
◇ 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上 （染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 ◇ 美蓝染色1-2min；石碳酸复红染色约1min。
5、水洗
倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂 片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载 玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松 散，乙醇脱色不能使其结构收 缩，其脂含量高,乙醇将脂溶 解，缝隙加大，结晶紫-碘复 合物溶出细胞壁，番红复染后 呈红色。
细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 鞭毛：运动，菌落形态。
实验材料
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌（2 day培养物）
操作步骤（continued） 6、干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
7、镜检（continued）
操作步骤（continued）
Notes:
1) 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油
2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净， 否则可能损害镜头
实验三 细菌的染色
油镜的使用 细菌的单染色法 细菌的革兰氏染色 芽孢染色
一 油镜的使用
实验目的
学习油镜的使用技术及维护的基本知识
初步认识细菌的基本形态
油镜使用的原理
油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时， 由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射， 降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率 与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光 量，从而使物象更加清晰。
革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色பைடு நூலகம்细 菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+） 和革兰氏阳性（G-）
革兰氏染色步骤: 1）结晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脱色； 4）番红复染
革兰氏染色的实验原理
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网 状分子形成一种透性屏障，当 乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔 障缩小，故保留结晶紫-碘复 合物在细胞膜上。呈紫色。
浸没油与玻璃的折射率相近
很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以 保证光洁度
3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最 后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油 镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片 或损伤镜面。
如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2 环直接涂于载玻片上。
Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取 菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2、干燥 室温自然干燥
操作步骤（continued）
3、固定
固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。
染色
镜检
操作步骤
操作步骤（continued）
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
1、涂片
操作步骤（continued）
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取） 生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无 菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑 取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。