寡核苷酸探针荧光原位杂交操作流程-细胞爬片

寡核苷酸探针原位杂交操作流程-细胞爬片

一、材料准备：

1.细胞爬片:细胞爬片经固定液-4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC，

固定15min。经无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。

2.探针: 多聚寡核苷酸探针-FITC 2ug/ml

二、 FISH操作流程

1.暴露mRNA 核酸片段：细胞爬片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸

加2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化5 分钟。

2.原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。蒸馏水洗1 次。

3.无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。

4.预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20-30%甲酰胺150ml 以保持湿度。按每张

爬片滴加20μl预杂交液。恒温箱37℃ 2小时。吸取多余液体，不洗。

5.杂交:按每张切片20μι杂交液(内含寡核苷酸探针-FITC,2.0ug/ml)，加在切片上。将

原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。如检测细胞爬片内的DNA需85-95℃变性6-8min；如检测细胞爬片内的RNA则无需变性。

6.恒温箱37℃杂交过夜(16h)。

7.杂交后洗涤:揭掉盖玻片，37℃水温的2×SSC 洗涤5 分钟×2 次；37℃ 0.5×SSC 洗

涤15 分钟×1 次; 37℃0.2×SSC 洗涤15 分钟×1 次。或75℃, 0.3XSSC洗5-8min。

8.PBS洗2*3min。

9.用内含0.001%DAPI缓中甘油封片,-20℃保存备用。