优选代谢物酶法分析技术

代谢物酶法分析技术的概念
➢酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶 促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利 用酶促反应测定酶活性的一类方法。
➢代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测 定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
目录
1 代谢物酶法分析的理论基础 2 代谢物酶法分析的方法 3 代谢物酶法分析的设计要求 4 小结与展望
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dt
积分得：
t
2.303
Km V max
lg
S0 St
若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标
准管与测定管反应时间（t）一致，则有：
lg
标准管S0 标准管St
lg
测定管S0 测定管St
标准管S0 标准管St
测定管S0 测定管St
(1) 平衡法基本理论
可简化为：
标准管 S 0 测定管 S 0
➢ 平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
(1) 平衡法基本理论
米氏方程
v
V max S Km S
改写为
v
d S
dt
V maxS Km S
dS (Km S ) V max S
dt
d
S
(
V
Km
max S
V
1 max
)
dt
积分得：
t
2.303
Km V max
lg
S 0 St
V max V max
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、[S0]有关， Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越小（待 测物越少）则达到平衡所需的时间越短。
(1) 平衡法基本理论
若 [S0] <<Km
dS (Km S V max S
)
dt
可简化为：
dS Km V max S
v
V max S Km S
❖ ①当[S] <<Km，则[S] + Km ≈ Km ❖ ②当酶量固定不变时，酶促反应的
最大速度Vmax也不变
符合一级酶促反应
米氏方程改为：
v V maxS KS
Km
(2) 速率法基本理论
若同时带标准管，则有：
标准管 v 测定管 v
标准管[S ] 测定管[S ]
➢标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu， 速度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管St 测定管St
标准管S0 测定管 S 0
St St
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消 耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来
表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示 为Cs和Cu。
Cs As Cu Au
(1) 平衡法基本理论
平衡法与速率法的相互联系
➢平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平 衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使 酶促反应成一级反应。
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2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
➢酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序； ➢试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品 对环境的污染； ➢酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。
S 0
V
St
max
式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度。
(1) 平衡法基本理论
以上积分式：
t
2.303
Km V max
lg
S 0 St
S 0
V
St
max
若反应达到平衡，假设
St S0
1%
，即
[S0]－[St]
≈
[S0]，
则可简化为： t 4.606 Km S0
代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性 测定范围等方面都优于传统的化学法
(1) 单酶反应直接法
➢待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为 直接法。
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定
尿酸 + O2 + H2O UAO 尿囊素 + CO2 + H2O2
标准管 / min 测定管 / min
Cs Cu
速率法测定代谢物浓度的原理
➢前提条件是测定初速度。越偏离初速度，测定误差则越大。
(2) 速率法基本理论
➢在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用 标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固 定时间法(fixed assay)。
优选代谢物酶法分析技术
教学目标与要求
❖ 掌握：代谢物酶法分析技术的概念，单酶反应直接法、 酶促偶联法等方法的设计原理，脱氢酶和过氧化物酶指示 系统的应用原理，以及平衡法和速率法的设计要求。 ❖ 熟悉：代谢物酶法分析技术的理论基础，酶循环法、酶 活性恢复法、激活剂和抑制剂测定法的设计原理，平衡法 和速率法的优缺点。 ❖ 了解：试剂酶的质量要求，以及代谢物酶法分析技术的 发展前景。
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降
胆红素测定
胆红素 + O2 B OD 胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
双底物反应直接测定法
➢对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底 物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应 动力学。
Cs As 此式是平衡法测定代谢物的基本原理 Cu Au
标准管 S 0 测定管 S 0
标准管St 测定管St
标准管S0 测定管 S 0
St St
此公式成立是前提条件
➢当 [S0]－[St] ≈ [S0]，即反应基本达到平衡，Au和As基 本稳定不变，此时测定误差最小。如果存在基质效应， 两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。
(2) 速率法基本理论
➢速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测 定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的 消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
(2) 速率法基本理论
根据米氏方程：
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代谢物酶法分析的理论基础
代谢物酶法分析
平衡法（终点法） 速率法（动力学法）
(1) 平衡法基本理论
➢平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。