李斯特菌检验

李斯特氏菌
李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。

感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

李斯特氏菌 - 概况
李斯特菌
李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。

李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。

肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。

李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。

其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

李斯特氏菌 - 特点
李斯特菌快速检测试剂盒
1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。

2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较
长时间生长繁殖。

3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。

4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。

李斯特氏菌 - 生存环境
单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况
李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。

这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。

据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。

人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

李斯特氏菌 - 生物学特性
1、形态与染色
单核细胞增多性李斯特菌鞭毛染色
该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

2、培养特性
该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2�5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。

该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8�4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。

在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。

在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。

在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

3、生化反应
电子显微镜下的单核细胞增多性李斯特菌
该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

4、血清型
根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。

致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。

5、抵抗力
该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。

该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

李斯特氏菌 - 致病性
澳洲食物中毒引发高度关注
单增李斯特菌进入人体是否得病与菌量和宿主的年龄免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能，因此，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人，免疫功能缺陷者。

潜伏期
在感染后3-70天出现症状，健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产。

病性机理
单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：
1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；
2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；
3、溶血素，即李斯特杆菌溶血素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。

临床表现
单核细胞增多性李斯特菌
健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

控制
单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。

单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。

由于单增李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。

冰箱食品需加热后再食用。

李斯特氏菌 - 检验
1、增菌培养
1. 将未开封的测试片贮藏在<= 8 oC (46 oF)的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。

在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。

取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。

取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。

2、分离
共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。

PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。

将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。

然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。

李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。

用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。

2. 已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。

加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。

在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。

李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。

在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。

食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。

挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。

30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。

3、鉴定步骤
3. 为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。

将胶带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。

请勿将测试片放在温度> 25 oC (77 oF)和(或)相对湿度> 50%的环境中。

（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。

在TSAYE上用已知菌作对照。

（2）、从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。

湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。

如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。

李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。

与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。

（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。

（4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。

但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。

在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。

4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。

湿润采样设备的液体应<= 10 mL。

湿润剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和缓冲液，如Letheen 肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。

（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。

TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。

（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。

单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。

（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。

（8）硝酸盐还原试验（选做）。

用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。

只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。

本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。

如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。

5. 在无菌环境下在收集的样品中添加5 mL，20-30oC，灭过菌的缓冲蛋白胨水(BPW)溶液。

不要将Petrifilm EL测试片与Vermont 培养基(UVM)、Fraser肉汤、李斯特菌增菌培养基(LEB)或缓冲李斯特菌增菌培养基(BLEB)共用。

（9）将TSBYE培养物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培养7天，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长。

在MTM中伞状生长更典型。

同时，30℃的TSBYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。

（10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培养7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖的情况见下表。

所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。

如果在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3 的LPM分离平板上菌落色素很明显，则七叶苷试验可免做。

4、血清学鉴定
6. 混合，蠕动或旋转样品与BPW的混合液将近一分钟。

将样品置于室温(20-30 oC) 1h，最久不超过1.5 h，以修复损伤的李斯特菌。

将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中，35℃培养24h，接种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培养24h。

用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。