抗体制备技术
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的牢固程度，以亲和常数表示。 测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非 竞争）结合等。
细胞破碎技术： 酶处理法 冻融法 超声破碎法 表面活性剂处理
常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组
织细胞。 特点：①此法适用多种微生物；
②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞 内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；
②多用于微生物和组织细胞的破碎。
原理：在适当的温度、pH及低离子强度的 条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。
常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子 型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚 山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。
应用：①破碎细菌，且作用比较温和；
②提取核酸时，常用此法破碎细胞。
可溶性抗原的提取
①超速离心分离—是一种根据分离物质的比 重特点，通过差速或梯度密度离心，将分 子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适 宜少数大分子物质的分离。
②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用 相应沉淀剂或利用某些条件促使抗原成分 沉淀的方法。最常用盐析法。
蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗
原和免疫佐剂～
1、颗粒性抗原制备： 颗粒性抗原主要是指细胞抗原、 细菌抗原和寄生虫体抗原。
绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血Βιβλιοθήκη Baidu）
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备 流程图
摇动
15-
20min
可 保
方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后 缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。
特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞 作用较差。
原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由 于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体 形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声 波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行， 避免长期超声产热，导致抗原破坏。
（三）免疫血清的纯化
1、特异性抗体的纯化 1）亲和层析 2）吸附 2、IgG类抗体的纯化 1）盐析 2）凝胶过滤 3）离子交换 4）亲和层析
(四)免疫血清的鉴定
1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA） 2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合
抗体制备技术
抗体技术的发展
多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一 种包含多种抗原表位的抗原免疫动物，可刺激机 体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同 抗体.
单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）由 一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源 抗体。
③层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和 层析等，用于抗原等物质的精提～
用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为 盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可 夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒 失水发生凝聚而沉淀析出。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
亲和层析的作用机理
3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。
抗体制备技术
（二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术
一、多克隆抗体制备
（一）免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原；
4、免疫佐剂（immunoadjuvant），与抗 原同时或预先注射于机体，能增强机体免 疫应答或改变免疫应答类型的物质。
种类—无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。
用途—抗原表面积增加，构型改变；延长 抗原的滞留时间；增强吞噬～
福氏佐剂(Freund adjuvant)
液体石蜡 ＋ 羊毛脂 混合 福氏不完全佐剂
蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
抗原性质分析结果
3、半抗原性免疫原的制备 半抗原（hapten） 蛋白质等载体（carrier） 连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原 化学法：利用某些功能基团把半 抗原连接到载体分子上
存
周
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌抗原的制备流程图
O菌体抗原
2、可溶性抗原制备： 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸等都是良 好的可溶性抗原，成分比较复杂，来源于 人和动物的组织和细胞，通常需要将组织 或细胞破碎，再经一定的方法提取和纯化。
抗原
完全 乳化
高压 加热 备用 灭菌
鉴定
水中
一滴 乳剂
乳剂不散 浮于液面
卡介苗
福氏完全佐剂
•作用大于不完全佐剂 •局部形成肉芽种和溃疡 •不能用于人体
（二）免疫动物
1、免疫动（物的选择：
①抗原来源与动物种属的关系（越近越差） ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，） ③抗原性质与动物种类 2、免疫的方法： 免疫原的剂量～ 免疫的途径与其间隔时间～ 免疫动物采血～ （对实验成功与否至关重要）
基因工程抗体（genetic engineering antibody）： 应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基 因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受 体细胞后重新表达的抗体。
抗原
表位A 表位B 表位C
克隆A
多
克
隆
克隆B
抗
体
克隆C
单克隆抗体
抗体制备技术
一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理
细胞破碎技术： 酶处理法 冻融法 超声破碎法 表面活性剂处理
常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组
织细胞。 特点：①此法适用多种微生物；
②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞 内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；
②多用于微生物和组织细胞的破碎。
原理：在适当的温度、pH及低离子强度的 条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。
常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子 型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚 山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。
应用：①破碎细菌，且作用比较温和；
②提取核酸时，常用此法破碎细胞。
可溶性抗原的提取
①超速离心分离—是一种根据分离物质的比 重特点，通过差速或梯度密度离心，将分 子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适 宜少数大分子物质的分离。
②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用 相应沉淀剂或利用某些条件促使抗原成分 沉淀的方法。最常用盐析法。
蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗
原和免疫佐剂～
1、颗粒性抗原制备： 颗粒性抗原主要是指细胞抗原、 细菌抗原和寄生虫体抗原。
绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血Βιβλιοθήκη Baidu）
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备 流程图
摇动
15-
20min
可 保
方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后 缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细 胞及细胞内的颗粒可被融破。
特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞 作用较差。
原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由 于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体 形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声 波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行， 避免长期超声产热，导致抗原破坏。
（三）免疫血清的纯化
1、特异性抗体的纯化 1）亲和层析 2）吸附 2、IgG类抗体的纯化 1）盐析 2）凝胶过滤 3）离子交换 4）亲和层析
(四)免疫血清的鉴定
1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA） 2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合
抗体制备技术
抗体技术的发展
多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一 种包含多种抗原表位的抗原免疫动物，可刺激机 体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同 抗体.
单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）由 一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源 抗体。
③层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和 层析等，用于抗原等物质的精提～
用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为 盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可 夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒 失水发生凝聚而沉淀析出。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
亲和层析的作用机理
3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。
抗体制备技术
（二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术
一、多克隆抗体制备
（一）免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原；
4、免疫佐剂（immunoadjuvant），与抗 原同时或预先注射于机体，能增强机体免 疫应答或改变免疫应答类型的物质。
种类—无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。
用途—抗原表面积增加，构型改变；延长 抗原的滞留时间；增强吞噬～
福氏佐剂(Freund adjuvant)
液体石蜡 ＋ 羊毛脂 混合 福氏不完全佐剂
蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹
抗原性质分析结果
3、半抗原性免疫原的制备 半抗原（hapten） 蛋白质等载体（carrier） 连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原 化学法：利用某些功能基团把半 抗原连接到载体分子上
存
周
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌抗原的制备流程图
O菌体抗原
2、可溶性抗原制备： 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸等都是良 好的可溶性抗原，成分比较复杂，来源于 人和动物的组织和细胞，通常需要将组织 或细胞破碎，再经一定的方法提取和纯化。
抗原
完全 乳化
高压 加热 备用 灭菌
鉴定
水中
一滴 乳剂
乳剂不散 浮于液面
卡介苗
福氏完全佐剂
•作用大于不完全佐剂 •局部形成肉芽种和溃疡 •不能用于人体
（二）免疫动物
1、免疫动（物的选择：
①抗原来源与动物种属的关系（越近越差） ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，） ③抗原性质与动物种类 2、免疫的方法： 免疫原的剂量～ 免疫的途径与其间隔时间～ 免疫动物采血～ （对实验成功与否至关重要）
基因工程抗体（genetic engineering antibody）： 应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基 因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受 体细胞后重新表达的抗体。
抗原
表位A 表位B 表位C
克隆A
多
克
隆
克隆B
抗
体
克隆C
单克隆抗体
抗体制备技术
一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理