酸溶性酶解大豆蛋白的研究

中图分类号：TS21；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2004)03-0024-08

酸溶性酶解大豆蛋白的研究

范宝庆1 陈中2

（1广东省石油化工研究院，广州510665）（2华南理工大学食品与生物工程学院，广州510641） 摘要：本论文通过酶法改性大豆蛋白，获得了在pH4.0条件下溶解良好的大豆蛋白。实验结果表明在1~3h的反应时间内，蛋白质经酶解达到了最大的的酸溶解性。最佳酶解工艺条件为：大豆分离蛋白浓度5%，酶用量5%(以反应物为100%计)，pH8.0，55℃，反应时间3.5h。在此条件下，大豆蛋白的水解值达到了10.35%。在实验中进一步通过采用SDS-PAGE电泳方法测定大豆蛋白酶解情况及产物分子量范围。

关键词：大豆分离蛋白；枯草杆菌酶Alcalase；酶水解

The Enzyme Hydrolysis of Dissolubility of the Soy Protein in Acid Condition

Fan Baoqing1, Chen Zhong

2

（1Guangdong research institute petrochemical industry, Guangzhou 510665）

（2 Food and Bio-engineering College, South China University of Technology, Guangzhou, 510640) Abstract: The dissolubility of the soy protein in acid condition is becoming an important problem to be solved. The best time for the enzyme hydrolysis and the best combination of conditions are studied. Result indicated that the best combination of parameters for Alcalase is 5%substrate，5%enzyme，pH8.0，55℃and 3.5h. The molecule weight of the soy protein is estimated by SDS-PAGE.

Keywords：Soy protein; Alcalase; Enzyme hydrolysis

酶解是大豆蛋白酶法改性的重要方法之一。限制性酶解不仅可提高大豆蛋白的溶解性、乳化性、发泡性和消化吸收率，而且可产生一些具有生理功效的小肽，其营养功能也得到提高，并且不对其风味、颜色产生显著影响。本实验所使用的Alcalase(枯草杆菌酶)是一种非特异蛋白质肽键内切酶，主要作用于含有酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的肽键。它由地衣芽泡杆菌生产，该酶的有效成分枯草杆菌蛋白酶A是一种碱性内切蛋白酶。主要作用于多肽链的内部与末端肽键。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆蛋白、全脂大豆蛋白粉购自市场；Alcalase蛋白酶由Novo Nodisk公司赠送。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量标准曲线测定

表1 加样次序

1 2 3 4 5 6 10g/L标准蛋白质溶液0.1 0.30.5 0.7 0.9—生理盐水0.9 0.70.5 0.3 0.1 1.0双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0蛋白质浓度(g/L) 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0—

收稿日期：2004-6-25

测定蛋白质含量标准曲线时按表1加样。测定样品时取0.1mL的样品液，加生理盐水0.9mL，再加入4mL的双缩脲溶液，混合后于37℃水浴中置15min，在520nm下测吸光值。

1.2.2 酶解大豆蛋白最佳工艺条件的确定

根据Novo Nodisk公司所提供的酶反应条件结合我们实验的具体情况，决定采用四因素三水平的正交实验，根据统计学原则按L9(34)设计正交表[22]，选择的条件见表2。

表2 正交试验的因素水平

因素三水平

底物浓度/% 2 5 7

酶用量/% 2 4 5

时间/h 0.5 2 3.5

温度/℃35 40 55 1.2.3 氨基氮及大豆蛋白水解度(DH)的测定

采用甲醛滴定法测定反应液中氨基氮的含量，蛋白质水解度(DH)按下式计算。

蛋白质水解度(DH)=氨基氮含量/总蛋白含量[23]

1.2.4 电泳

通过采用SDS-PAGE电泳测定大豆蛋白酶解前后分子量的变化情况。通过以低分子量标准蛋白的分子量对数对其相对迁移率作图，然后根据所测定样品的

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相对迁移率可计算出其分子量。相对迁移率R f 可用下式计算：

R f =蛋白质区带移动距离 / 溴酚蓝移动距离 2 结果与讨论

2.1 蛋白质浓度测定标准曲线（见图1）

00.20.40.60.811.20

1

3579

Protein Concentration

A 520

图1 标准曲线图

2.2 酶法改性大豆蛋白的最适条件

正交实验结果见表3。由表3可以看出枯草杆菌酶水解大豆分离蛋白的最佳工艺条件是8号。8号具体条件为：温度55℃、pH8.0、底物浓度5%、酶用量5%(以底物量计)、水解时间为3.5h 。经酶解后的大豆蛋白的酸溶情况比未酶解的改良很多，酸溶下的反应最佳工艺条件与未酸溶的一样。

表3 最佳反应条件的测定结果

实验编号

调pH 至4.0前 调pH 至4.0后A 520 可溶性蛋白质含量(g/100mL) 水解度(%) A 520 可溶性蛋白质含量(g/100mL)

1 0.434 0.368 18.40 0.406 0.344

2 0.442 0.375 18.76 0.437 0.371

3 0.716 0.625 31.30 0.68

4 0.594 4 0.461 0.391 7.82 0.426 0.361

5 0.710 0.618 12.3

6 0.682 0.592 6 0.702 0.611 12.22 0.67

7 0.587 7 0.853 0.765 10.93 0.799 0.706

8 0.916

0.835

11.93 0.895

0.812

9 0.815 0.723 10.33 0.814 0.722

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2.3 测定最佳工艺条件下的大豆蛋白水解度

水解液氨基氮的测定结果为：0.06468 g/100mL ，因此大豆蛋白的水解度为：DH=0.06468/0.625=10.35% 2.4 酶解蛋白电泳结果(图2、图3)

如图2、图3所示，用低分子量标准蛋白分子量的对数对样品相对迁移率作图，回归方程为：

分子量对数(lgM)= -1.5412×相对迁移率 + 5.2193， 相关系数R = -0.9928

可见，大豆蛋白经Alcalase 酶水解后分子量为20.1kD 以下。

1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 图2 各蛋白样品的电泳图 图3 大豆蛋白电泳图 其中：

图2：1-标准蛋白；2,3-未酶解大豆蛋白；4 -酶解后大豆蛋白

图3：1- 酶解 pH8.0，55℃，0.5h ；2- 酶解 pH8.0，55℃，1h ；

3- 酶解 pH8.0，55℃，2h ； 4- 酶解 pH8.0，55℃，6h ； 5- 酶解 pH8.0，55℃，10h ； 6- 酶解 pH8.0，55℃，14h ； 7.大豆分离蛋白（未加酶）。

3 结论

由上述试验结果得到以下结论：(1)由Alcalase 酶解后，大豆蛋白的溶解量增加，同时也增加了其酸溶性；(2)Alcalase 水解大豆分离蛋白的最佳工艺条件是：温度55℃、pH 值8.0、底物浓度5%、酶用量5%、水解时间为3.5h ；(3)大豆蛋白酶解后的水解度为10.3%；（4）大豆蛋白酶解后分子量降至14.4kD ～20.1kD 。

我国目前正在实施的“大豆行动计划”战略，使我国的大豆资源可得到最大的利用。利用酶解技术对大豆蛋白原料进行改性、深度加工和分离，制造出具有特定功能性和营养性的大豆蛋白和蛋白肽系列工程化产品，将其应用于婴幼儿配方豆奶、儿童营养酸豆奶、功能性大豆蛋白肽饮料等食品的生产中，可带动我国整个大豆产品生产行业的全面进步。

参考文献

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2 李川,李亚娜,刘虎成,蒋和体,陈宗道.大豆蛋白改性.食品工业科技,2000,(3)：75-76

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5

雷籽耘,李丹,周书华,雷海容.大豆蛋白功能特性的利用及改性技术研究.大豆新加工技术原理与应用.北京:科学技术文献出版社,1999,(3)：83-96