第05章 代谢物酶法分析技术
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第五章
代谢物酶法分析技术
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一 种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生
物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。
检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定 NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通
第五章
代谢物酶法分析技术
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
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第五章
代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
乳酸测定
乳酸 + NAD+
LD
丙酮酸 + NADH + H+
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
直接法。
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5
第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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6
第五章
代谢物酶法分析技术
全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）
16
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
过Trinder 反应比色测定。
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23
第五章
代谢物酶法分析技术
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
第五章
代谢物酶法分析技术
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第五章
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测
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第五章
代谢物酶法分析技术
过氧化物酶指示系统
血清总胆固醇氧化酶测定法
胆固醇酯 + H2O
胆固醇 + O2
COD
胆固醇 + 脂肪酸
△4-胆甾烯酮 + H2O2 红色醌类化合物
H2O2 + 4-AAP + 酚
定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
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2
第五章
代谢物酶法分析技术
1
代谢物酶法分析的理论基础
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
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3
第五章
代谢物酶法分析技术
9
第五章
代谢物酶法分析技术
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
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15
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、
产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶 血等色素干扰。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
4
第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
氨循环－合成酶－脱氢酶系统
NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转 化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和
NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成
NADH，在340nm测定。
平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
ATP NAD合成酶 AMP+PPi NH4+ + 脱氨-NAD
Mg2+
NAD+ 亮氨酸
亮氨酸脱氢酶
NH4+ + 氧化异己酸 NADH
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第五章
代谢物酶法分析技术
酶循环法具有的特点
灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
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17
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
(1)
平衡法基本理论
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。
平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
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2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性 测定范围等方面都优于传统的化学法
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
系统。
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第五章
代谢物酶法分析技术Βιβλιοθήκη Baidu
过氧化物酶指示系统
共用的指示反应 最早由Trinder氏 等人提出，被称 为Trinder反应
最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。
已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油 三酯等项目的测定
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
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第五章
代谢物酶法分析技术
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。
A Ea B Ei C
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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14
第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定
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第五章
代谢物酶法分析技术
过氧化物酶指示系统
常用的Trinder反应生色基团 化学名 酚 2，4-二氯酚 N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺 N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺 N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺 英文缩写 P 2，4-DCP EMAE TOOS ESPDMA 最大吸收峰 （nm） 500 510 555 555 585
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第五章
代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底
物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应
用395 nm ～415 nm 波长测定反应中氧化型thioNAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。 循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。
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在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A
第五章
代谢物酶法分析技术
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一 种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生
物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。
检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定 NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通
第五章
代谢物酶法分析技术
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
血淸胆汁酸测定
Thio-NAD+
3α -HSD
Thio-NADH(黄色) 循环
3α -HSD
胆汁酸 NAD+
3-酮类固醇 NADH
胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代
还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测 物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。
动力学。 但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中， 因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。
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第五章
代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
乳酸测定
乳酸 + NAD+
LD
丙酮酸 + NADH + H+
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第五章
代谢物酶法分析技术
(1)
单酶反应直接法
待测物与产物在理化性质上有便于检测的信 号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产 物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为
直接法。
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代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 <5%， 只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用
标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固
定时间法(fixed assay)。
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6
第五章
代谢物酶法分析技术
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清尿素测定 尿素 + H2O
尿素酶
2NH3 + CO2
NH3 + α-酮戊二酸 + NADH + H+
谷氨酸 + H2O + NAD+
测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正
过Trinder 反应比色测定。
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第五章
代谢物酶法分析技术
产物循环－氧化酶－脱氢酶系统
甘油浓度测定
ATP 甘油
GK
ADP
NAD+
G-3-PDH GPO
NADH+H+ 磷酸二羟丙酮 H2O2
甘油-3-磷酸 O2
通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复
第五章
代谢物酶法分析技术
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第五章
代谢物酶法分析技术
代谢物酶法分析技术的概念
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶
促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利
用酶促反应测定酶活性的一类方法。
代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测
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第五章
代谢物酶法分析技术
过氧化物酶指示系统
血清总胆固醇氧化酶测定法
胆固醇酯 + H2O
胆固醇 + O2
COD
胆固醇 + 脂肪酸
△4-胆甾烯酮 + H2O2 红色醌类化合物
H2O2 + 4-AAP + 酚
定人体內的代谢物或代谢产物的技术。
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2
第五章
代谢物酶法分析技术
1
代谢物酶法分析的理论基础
平衡法（终点法） 代谢物酶法分析 速率法（动力学法）
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3
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9
第五章
代谢物酶法分析技术
单底物反应直接测定法
尿酸紫外法测定 尿酸 + O2 + H2O
UAO
尿囊素 + CO2 + H2O2
尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在 293 nm 处测定吸光度下降 胆红素测定 胆红素 + O2
BOD
胆绿素+ H2O
胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在 450nm处测定吸光度下降
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代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
血清葡萄糖己糖激酶法测定
Glu + ATP
G-6-P +
G-6-P+ADP
P-6-GA + NADPH + H+
NADP+
G 6 PD
指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定 340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比
表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、
产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶 血等色素干扰。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(3)
酶循环法
利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促
反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应
产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质
的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定 于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两 种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的 Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
速率法基本理论
速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测
定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的
消耗量较小时(<5%)，酶促反应呈一级反应，此时的 反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。
速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
氨循环－合成酶－脱氢酶系统
NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转 化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和
NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成
NADH，在340nm测定。
平衡法与速率法的相互联系
平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反 应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会 达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平
衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使
酶促反应成一级反应。
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第五章
代谢物酶法分析技术
ATP NAD合成酶 AMP+PPi NH4+ + 脱氨-NAD
Mg2+
NAD+ 亮氨酸
亮氨酸脱氢酶
NH4+ + 氧化异己酸 NADH
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第五章
代谢物酶法分析技术
酶循环法具有的特点
灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定
比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。
体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁
酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及
(1)
平衡法基本理论
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐 渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示 反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称 为终点法(end-point method)。
平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”。
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2
代谢物酶法分析的方法
代谢物酶法分析主要优点
酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理 就能测定，简化了实验程序；
试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品
对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性 测定范围等方面都优于传统的化学法
氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示
系统。
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过氧化物酶指示系统
共用的指示反应 最早由Trinder氏 等人提出，被称 为Trinder反应
最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。
已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油 三酯等项目的测定
循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环 不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计 的量决定于t 和每min循环次数。
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第五章
代谢物酶法分析技术
底物循环－脱氢酶－辅酶系统
用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。
A Ea B Ei C
最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.
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第五章
代谢物酶法分析技术
脱氢酶指示系统
以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶 Ⅰ(NAD+) 或氧化型辅酶Ⅱ(NADP+)变为还原型
NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被
测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型 NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处 吸光度的下降来计算被测物的浓度。
指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定
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过氧化物酶指示系统
常用的Trinder反应生色基团 化学名 酚 2，4-二氯酚 N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺 N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺 N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺 英文缩写 P 2，4-DCP EMAE TOOS ESPDMA 最大吸收峰 （nm） 500 510 555 555 585
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代谢物酶法分析技术
双底物反应直接测定法
对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设 计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大， 即[S2] >> Km2，这时的酶促反应动力学可按单底
物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应
用395 nm ～415 nm 波长测定反应中氧化型thioNAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。 循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。
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在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法 丙酮酸测定 丙酮酸 + NADH + H+
LD
乳酸 + NAD+
在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法
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第五章
代谢物酶法分析技术
(2)
酶偶联法
酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分， 将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到 检测目的的方法称酶促偶联法。 A