基因工程药物制备的流程

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二零一一年九月

基因工程药物制备的流程

学生姓名： 系 别： 专 业： 班 级： 指导教师：

学校代码： 10128

学 号：

融合蛋白EGF。E40rf4的表达与纯化

1．大规模摇瓶表达

刮取平板上的单克隆菌株，接种于20 ml YPD液体培养基，28～30。C，200～230rpm振荡培养20 h后，将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜，使OD600达到15～18，室温离心15009，收集菌体，重悬于500ml BMMY,振荡培养24h后按最佳诱导条件每天追加甲醇5ml，使甲醇浓度保持在1％。诱导96 h后，离心收集上清。大体积培养时，注意保持通气和温度，培养体积不应超过摇瓶容积的1／4，瓶口用四层纱布罩好，控制摇床转速在200—230 rpm，温度28～30℃。

2．高密度发酵

取．80℃保存的菌株，接种于20 ml BMG液体培养基，28—30。C，200—230rpm 振荡培养20h后，将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜。2L BMG置5L发酵罐内灭菌，用NH40H调pH至6．0，将100 ml菌液接种于BMG中，28℃培养，空气泵持续通氧，保持溶氧在30％以上，搅拌转速800 rpm左右，约20小时甘油耗尽(表现为溶氧上升)。流加含6 ml PTMl微量盐溶液的50％甘油500ml。待甘油流加完毕并且罐内甘油耗竭，补1％酵母提取物和2％蛋白胨以防止蛋白降解，开始流加含12ml／LPTMl的甲醇进行诱导。通过观察溶氧变化调整甲醇流加速度，定期取样测OD600值，镜检监测菌体状态，每12 h留取表达上清，诱导3-4天下罐，离心收集上清。

3．SDS．PAGE蛋白电泳

(1) 采用TCA沉淀对表达上清进行浓缩的方法如下：取0．5～1．0 ml样品，加入1／10体积100％(W／V)TCA溶液，混匀，冰浴长于30 min：44C，12，000rpm，离心15min；弃上清，加入．20 4C保存的丙酮o．5～1．O rIll，4℃，12，000rpm，离心5min：重复一次；沉淀室温晾干，溶于20—40 p11×蛋白上样缓冲液中。(2) SDS．PAGE蛋白电泳：分离胶浓度为15％，含0．375 mol／L"Iris，pH 8．8，0．1％SDS，0．1％AP,0．04％TEMED；浓缩胶为5％，含0．125mol／L Tris，pH 6．8，0．1％SDS，O．1％AP,0．1％TEMED。样品100变性3min后上样。在Tris．甘氨酸电泳缓冲液中以50—60V(浓缩胶中)／100～120V(分离胶中)电泳，至溴酚蓝刚出分离胶。

4．蛋白质染色

硝酸银染色：用5倍于凝胶体积的固定液(50％乙醇，lO％乙酸)固定凝胶上的蛋白质，室温平缓摇动30 min以上，用含10％乙醇、5％乙酸的漂洗液洗两次，每次5 min；8．3％戊二醛固定10 rain；漂洗液洗两次，每次5 min；去离子水洗两次，每次5 min；加入O．25％硝酸银溶液，平缓摇动15 min；用去离子水冲洗两次，每次30 sec；加入5倍体积新鲜配制的显色液显色，待蛋白条带达到所需强度，用lO％乙酸终止显色反应。

5．Western blotting

(1)转膜：SDS．PAGE蛋白电泳结束后，凝胶于电转缓冲液中浸泡10 min，戴手套将硝酸纤维素膜和四张滤纸剪成与胶相同大小，于电转缓冲液中浸5 min以上，将凝胶及与之相贴的硝酸纤维素膜夹于四张滤纸、两张网垫及两个多孔塑料板间，将此装置置于电转槽中，令硝酸纤维素膜靠近阳极，4。C，恒压100V，电转

l～1．5 h。

(2)封闭：取下硝酸纤维素膜，置滤纸上吸去多余水分，根据预染标准蛋白标记确定电转移是否成功。明确标准蛋白已从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜后，将滤膜移入塑料袋，按O．5ml／cm2加入含5％脱脂奶粉的PBS．T封闭液，封好，室温封闭l一2h。

(3)抗原抗体反应：将塑料袋剪一小口，弃去封闭液，按O．1ml／em2加入含有l：500稀释抗人EGF单克隆抗体或1：500兔抗人E40rf4抗血清的封闭液，室温孵育1～2h或4。C过夜。取出滤膜，以TBS．T洗膜，10 min／次，三次。将滤膜移入另一新塑料袋，加入用TBS—T稀释的HRP标记的山羊抗小鼠或羊抗兔IgG(1：2000)，室温孵育I-2 h，TBS．T洗膜10rain／次，三次，TBS洗膜10rnin，一次。

(4)化学发光反应：以O．1ml／cmz将等体积的化学发光试剂A、B液混匀，滴在硝酸纤维素膜上5rain，将膜用保鲜膜包好，根据荧光强度，在X．光底片上分别做不同时间的曝光。曝光后的X．光片依次在显影液、定影液中各浸泡3min。最后，将X．光片用清水冲洗，晾干。

6．融合蛋白EGF．E40rf4的纯化

采用FPLC系统进行阴离子交换和凝胶过滤柱层析纯化。阴离子交换层析柱：XK26，层析介质：Q Sepharose Fast Flow，柱体积50 Ild；凝胶过滤层析柱：Hi load16／60，层析介质：Superdex75，柱体积120 ml。层析缓冲液见实验方法部分。

(1)样品处理：酵母表达上清用0．22}tm的微孔滤膜过滤后经截流分子量为50kD 的膜包超滤浓缩，加入5倍体积BufferA稀释，再次浓缩，重复4次左右。

(2)阴离子交换层析：用5个柱体积的BufferA平衡介质后，上样，流速5 ml／min，用Buffer A将上样峰洗至基线后，调整流速至3 ml／min，先用bu脆r A和Buffer B进行不同盐浓度梯度洗脱，分管收集洗脱峰，SDS．PAGE蛋白电泳鉴定。

(3)凝胶过滤层析：用2个柱体积的凝胶过滤缓冲液平衡介质后，上样，流速lml ／min，用凝胶过滤缓冲液洗脱，分管收集洗脱峰，SDS．PAGE蛋白电泳鉴定。 (4)纯化蛋白处理：收集经电泳鉴定后含有融合蛋白的洗脱液，10 kD超滤管离心浓缩后用O．22岬滤膜过滤除菌，小量分装，--20℃保存，并作蛋白定量(BCA 法)。

7．蛋白定量(BCA法)

(1)标准曲线的绘制：用磷酸缓冲液配制标准蛋白溶液，分别含有0，5，25，50，125，250 lxg BSA标准蛋白溶液，终体积为1009l，加到96孔板上，每孔25vl，每个浓度设置三孔平行。根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加l体积BCA 试NB(50：1)配制适量，混匀后加入96孔板，每孔2001xl，60℃，30 min，A570比色，测定吸光度值，以蛋白含量为横坐标，A570值为纵坐标作图。

(2)样品测定：样品可作适当稀释，同上测定，从标准曲线上查出其相应含量。8．Superose 6 HR 10／30

第一次使用前，平衡需用12 IIll去离子水(流速O．2 ml／min)，38 ml去离子水(0．5ml／min)和50 ml Superose 6缓冲液(0．5 ml／min)。平衡后，上样，样品体积限制在500山内，流速0．5 ml／min，用Superose 6缓冲液洗脱，分管收集洗脱峰。

9．N末端氨基酸序列分析

取纯化的EGF．E40rf4经15％SDS．PAGE分离，电泳结束后将凝胶放在CAPS电印迹缓冲液浸泡5 min。PVDF膜用甲醇浸湿后放入CAPS缓冲液中，将凝胶和膜按顺